背景介紹: CAR-T療法風潮

       基于Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T)技術的細胞ZL可謂是當下Z火熱的腫瘤ZL方法之一。與早期的基于T細胞的Adoptive cell transfer（ACT）不同，CAR-T技術融入B細胞，也就是抗體的識別能力。因此CAR-T能靶向MHC異常表達或不表達的腫瘤細胞，并能作用于多數傳統ACT無法靶向的細胞膜表面靶點^[1]。

CAR-T原理圖，來源于參考資料^[1]

       隨著在B細胞血液腫瘤領域的巨大成功，CAR-T療法的臨床前研究和臨床試驗發展迅速。目前，就臨床數目而言，CAR-T療法在腫瘤免疫領域僅次于基于免疫檢查點YZ劑的療法。ZG和美國則是推動CAR-T療法臨床轉化的主力軍^[2]。相較于美國，接近八成的國內研究已處于臨床階段。同時，對比2018年，我們可以看到國內制藥企業對于CAR-T療法的布局和推動^[2]。

CAR-TZL臨床研究數目，來源于參考資料^[2]

       當下，如何將CAR-T療法的成功復制至非B細胞血液腫瘤和實體瘤是該領域研究的關鍵點和ZD。在實體瘤研究方向，體內研究和臨床試驗證明Therapeutic window的存在，并發現CAR-T細胞能清除靶點陰性的腫瘤細胞，為攻克實體瘤提供一絲曙光^[2]。除了腫瘤領域，CAR-T研究已衍生至心臟損傷^[3]，HIV^[4]和自身免疫^[5]等多個疾病領域，成為了非常有潛力的新興ZL技術。

       在此，結合一線的研究進展，我們向大家介紹珀金埃爾默生命科學產品線針對CAR-T研究的應用切入點，助力下一代CAR-T療法研發。

體外研究應用：

       針對CAR-T研究，珀金埃爾默主要圍繞體外和體內兩個方向提供完善的解決方案。其中，針對體外研究，我們關注體外CAR-T細胞的活化、活力檢測和分析。與Cytotoxic T細胞活化類似，CAR-T細胞的活化通常伴隨著細胞因子的分泌、CAR-T細胞的增殖和Z后特異性靶向腫瘤細胞的殺傷 ^[6]。針對這三個過程，我們均提供對應的基于放射/非放射平臺的金標準解決方案。在此，我們關注CAR-T細胞核心功能指標：細胞殺傷的檢測。

1. 靈活應用細胞殺傷解決方案

       與傳統的基于化合物和抗體的直接細胞殺傷不同，基于CAR-T細胞的腫瘤殺傷是細胞-細胞相互作用的結果。因此，在分析殺傷中，檢測方法必須能夠特異區別靶細胞（腫瘤細胞）和效應細胞（CAR-T細胞）。常見的細胞活力檢測法，如MTT、CCK-8和ATP法等，則不適于直接用于CAR-T介導的特異細胞殺傷檢測。針對區分的需求，我們提供兩大金標準檢測法：基于放射的⁵¹Cr釋放法和基于非放射的DELFIA? EuTDA細胞毒法^[7]。兩種方法都基于利用探針GX、特異的標記靶細胞。經效應細胞殺傷后，靶細胞出現裂解，并釋放探針到上清中用于定量殺傷效果。

⁵¹Cr釋放法檢測原理圖，圖片來源于參考資料^[8]

       除了支持特異檢測細胞殺傷外，⁵¹Cr釋放法和 DELFIA^? EuTDA細胞毒法的另外一大優勢就是靈活性，支持多種細胞系和原代細胞作為靶細胞或效應細胞。例如，在近期的靶向CD19的CAR-T臨床研究中，科研人員通過標記腫瘤細胞，利用⁵¹Cr釋放法證明低親和力的CAR-T 具有更強的細胞殺傷能力。而在后續的CAR-T無效的病人樣本研究中，基于同樣的檢測方法，科研人員通過標記CAR-T細胞作為靶細胞，檢測病人針對CAR-T細胞是否具有免疫反應（Anti-CAR反應）^[9]。

體外殺傷檢測結果。CAT為低親和力CAR-T，FMC83為常用CAR-T

基于病人臨床樣本的Anti-CAR檢測結果。圖片來源于參考資料^[9]

       通過改變靶細胞，我們提供的方法學還支持CAR-T療法的安全性分析，例如檢測On target, off tumor脫靶效應帶來的細胞毒性^[10]。此外，同種異體反應也逐漸成為CAR-T療法安全性評價的一個重要考慮因素。針對此，我們提供DELFIA^?BrdU 細胞增殖方法，通過混合淋巴細胞反應衡量CAR-T細胞的同種異體反應^[11]。

利用⁵¹Cr釋放法檢測脫靶效應的細胞毒性，圖片來源于參考資料^[10]；

基于DELFIA^?BrdU 細胞增殖方法檢測CAR-T細胞的同種異體反應，圖片來源于參考資料^[11]

2. 深入成像技術應用

       相較于分子檢測，成像技術能提供二維到三維的靜止或動態空間信息。因此基于成像的高通量篩選更具有選擇性，適合差異化篩選。例如，在2017年的臨床研究中，科研人員利用Opera Phenix高內涵平臺，結合腫瘤細胞/正常細胞混合樣本進行差異化篩選。利用成像技術的優勢，研究能極ng確發現只作用于腫瘤細胞、不影響正常細胞活力的藥物，提升了臨床用藥的安全性^[12]。除了提升選擇性外，成像篩選還能支持幾小時到幾天的長程篩選，因此可用于檢測免疫細胞的多輪殺傷能力^[13]。

基于Opera Phenix 的高通量差異篩選流程圖，圖片來源于參考資料^[12]

       毫無疑問，憑借其生理相關性和支持高通量篩選的優勢，3D類器官和微組織球研究是當下多個科研和制藥領域的熱門主題和方向，也是我們成像應用的重要關注點。針對多種腫瘤，基于小分子藥物的研究已證實3D腫瘤組織樣本能有效預測藥物敏感度^[14]。在CAR-T和細胞ZL研究方向，3D水平研究也逐漸嶄露頭角。在近期的研究中，Opera Phenix高內涵平臺被用于衡量、對比靶向Mesothelin的CAR-T細胞的殺傷能力 ^[15] 。除了3D水平研究外，活細胞動態監測也會成為我們針對CAR-T研究的主要開拓點。與干細胞類似，CAR-T細胞和免疫細胞在活化和行使功能過程中是代謝水平高度動態的，并持續存在和癌細胞及其他免疫細胞的相互作用 ^[16]。因此，基于成像的動態分析非常適合在體外深入解析CAR-T細胞的功能潛能。

利用Opera Phenix 檢測CAR-T細胞針對3D腫瘤樣本的殺傷能力，圖片來源于參考資料^[15]

體內研究應用：

       針對體內研究，珀金埃爾默主要提供完善的活體成像解決方案，包括性能zhuo越的IVIS系列和對應的細胞株和熒光染料。作為主流的活體成像平臺，IVIS系列被廣泛用于臨床前CAR-T研究和突破實體瘤ZL的多種瓶頸^[1]。在此，我們主要介紹助力下一代CAR-T研發的兩大利器：腫瘤成像和免疫細胞成像。

1. 腫瘤活體成像：協助建立復雜的腫瘤模型

       圍繞CAR-T臨床前研發，IVIS系列能協助建立多種常見的實體瘤和血液瘤模型，靈敏追蹤腫瘤的進展和動態評估CAR-T細胞的作用。在此基礎上，IVIS系列還可以和多種新興的技術聯用，協助建立復雜的腫瘤表型。例如，在靶向多發性骨 髓瘤的CAR-T臨床ZL中，一個常見的挑戰就是BCMA陰性腫瘤細胞的存在和出現。對此，研究結合Crispr技術，建立融合螢火蟲報告基因的BCMA陰性腫瘤細胞，并將其混合BCMA陽性腫瘤細胞建立腫瘤模型。活體成像數據可以看出，BCMA CAR-T細胞無法作用于BCMA陰性腫瘤細胞，而靶向GPRC5D的CAR-T細胞能有效根除BCMA陰性腫瘤細胞^[17]。

結合Crispr技術的腫瘤模型建立和活體成像檢測，圖片來源于參考資料^[17]

       同樣基于Crispr技術，近期的研究利用活體成像平臺開展和驗證靶向CD8 T細胞的活體Crispr篩選，為靶向膠質母細胞瘤的免疫ZL提供了新的靶點^[18]。通過改變接種的流程和ZL策略，IVIS系列還可以協助建立腫瘤復發、晚期腫瘤和病人來源移植腫瘤模型。

基于Crispr技術的體內篩選驗證流程，圖片來源于參考資料^[18]

2. 免疫細胞活體成像：直觀展示體內免疫細胞-腫瘤細胞相互作用

       除了腫瘤細胞成像，我們還能通過標記CAR-T細胞或其他免疫細胞進行活體成像^[17]。該應用對于CAR-T和其他免疫療法的研究尤為重要。因為通過活體成像，我們能直觀的監測、分析免疫細胞的體內動態分布和遷移等關鍵的信息。鑒于CAR-T細胞體內的擴增、遷移和腫瘤部位的殺傷功能是當下CAR-T臨床應用的主要限制因素^[1]。這些信息的獲得對于新一代CAR-T研發至關重要。

       在近期的一份研究中，科研人員展示了CAR-T細胞遷移能力對于殺傷效果的重要性^[19]。利用腫瘤細胞，尤其是在輻射處理后，會過表達IL-18的特點，研究人員改造CAR-T細胞，使其過表達IL-18受體 CXCR-1或CXCR-2來提升體內的遷移能力。結合帶有報告基因的CAR-T細胞和過表達遠紅外蛋白iRFP720的腫瘤細胞，研究就能直觀追蹤和對比免疫細胞的分布變化和腫瘤的進展情況，做到體內水平的細胞細胞相互作用研究。相較于對照細胞，改造的CAR-T細胞具有更強的遷移能力和殺傷腫瘤能力。同時，在晚期腫瘤模型上，研究證實未改造CAR-T細胞主要分布于外周，不能有效靶向腫瘤部位^[19]。

CAR-T體內模型的CAR-T細胞成像（左，化學發光）和腫瘤細胞成像（中，熒光）；右圖為對應統計數據，圖片基于參考資料^[19]

       進一步結合免疫熒光技術，研究證實了由IVIS采集的化學發光信號能有效反映ZL早期的CAR-T細胞浸潤情況，是腫瘤微環境免疫細胞活體追蹤的有力手段。同時，ZL早期的化學發光信號也能有效預測小鼠的生存時間，為CAR-TLX預測提供了新的切入點。Z后，同時結合腫瘤和CAR-T細胞活體成像，我們還能做到靶向CAR-T細胞功能水平的持續監測。在S次腫瘤消退后，我們再次植入腫瘤細胞，建立Re-challenge模型，通過活體成像直觀評價CAR-T細胞的長期分布和功能^[19]。

利用免疫熒光和活體成像技術追蹤ZL早期CAR-T細胞的侵潤情況；CD45指示CAR-T細胞，圖片來源于參考資料^[19]

參考資料：

1. Robbie G. Majzner and Crystal L. Mackall?.Clinical lessons learned from the first leg of the CAR T cell journey. Nat Med. 2019 Sep;25(9):1341-1355.

2. Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer Nat Rev Drug Discov. 2019 Oct;18(11):821-822.

3. Haig Aghajanian, et al. Targeting cardiac fibrosis with engineered T cells. Nature. 2019 Sep;573(7774):430-433.

4. Herzig E, et al. Attacking Latent HIV with convertibleCAR-T Cells, a Highly Adaptable Kil領 Platform. Cell. 2019 Oct 31;179(4):880-894.e10.

5. Taking CAR-T Cells Beyond Cancer: A New Therapy for Autoimmune Disease https://www.labiotech.eu/interviews/car-t-cells-txcell-treg-cells/

6. Restifo NP , et al. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 2012 Mar 22;12(4):269-81. 

7. 細胞ZL干貨 | 免疫細胞殺傷經典案例https://mp.weixin.qq.com/s/47krDPy-vsxSP91T1GDw

8. van der Haar àvila I , et al.  Evaluating Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity by Chromium Release Assay. Methods Mol Biol. 2019;1913:167-179.

9. Ghorashian S , et al. Enhanced CAR T cell expansion and prolonged persistence in pediatric patients with ALL treated with a low-affinity CD19 CAR. Nat Med. 2019 Sep;25(9):1408-1414

10. Fisher J , et al.  Engineering γδT cells limits tonic signa領 associated with chimeric antigen receptors. Sci Signal. 2019 Sep 10;12(598).

11. Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory response without graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb;29(2):387-95.

12. Snijder B, et al. Image-based ex-vivo drug screening for patients with aggressive haematological malignancies: interim results from a single-arm, open-label, pilot study. Lancet Haematol. 2017 Dec;4(12):e595-e606.

13. Hernandez-Hoyos G, et al. MOR209/ES414, a Novel Bispecific Antibody Targeting PSMA for the Treatment of Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer. Mol Cancer Ther. 2016 Sep;15(9):2155-65.

14. Lee JK, et al. Pharmacogenomic landscape of patient-derived tumor cells informs precision oncology therapy；Nat Genet. 2018 Oct;50(10):1399-1411.

15. Zhang Z, et al.Modified CAR T cells targeting membrane-proximal epitope of mesothelin enhances the antitumor function against large solid tumor. Cell Death Dis. 2019 Jun 17;10(7):476.

16. Sukumar M, et al.Metabolic reprograming of anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol. 2017 Jun;46:14-22.

17. Smith EL, et al.GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Sci Transl Med. 2019 Mar 27;11(485).

18. Ye L, et al.In vivo CRISPR screening in CD8 T cells with AAV-Sleeping Beauty hybrid vectors identifies membrane targets for improving immunotherapy for glioblastoma. Nat Biotechnol. 2019 Nov;37(11):1302-1313.

19. Jin L, et al.CXCR1- or CXCR2-modified CAR T cells co-opt IL-8 for maximal antitumor efficacy in solid tumors. Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):4016.

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報告題目：從基因到表型組學的藥物研發一體化智能平臺

報告人：珀金埃爾默市場開發主管 徐雍羽博士

報告時間：11月30日9:20-9:45

報告地點：細胞ZL與基因ZL分會場

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