質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理是什么？

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的各種方法及原理是生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)濃度的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于研究生物分子相互作用、蛋白質(zhì)功能和動(dòng)力學(xué)、以及生物樣品的分析和鑒定等方面都具有重要的意義。本文將介紹幾種常用的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法及其原理，包括紫外吸收法、微量凱氏定氮法、雙縮尿法、Lowry 法和考馬斯亮藍(lán)法等。通過(guò)對(duì)這些方法的比較和分析，可以更好地了解它們的優(yōu)缺點(diǎn)，以便根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

①紫外吸收法

檢測(cè)原理：

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共扼雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

方法特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。

缺點(diǎn)：測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多。

干擾物：含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物質(zhì)。

檢出限：50~100ug蛋白含量。

適用范圍：適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。

②微量凱氏定氮法

凱氏定氮法被國(guó)內(nèi)外視為蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，可作為衡量其他蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)原理：

樣品與濃硫酸共熱，含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。

方法特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：通用性強(qiáng)，測(cè)定費(fèi)用低，易實(shí)現(xiàn)，儀器簡(jiǎn)單且測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性好。

缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低。

檢出限：0.2~1mg蛋白含量。

適用范圍：凱氏定氮法測(cè)的是總蛋白的量，一些非蛋白氮無(wú)法檢測(cè)出。

③雙縮尿法

實(shí)驗(yàn)原理：

雙縮尿（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿溶液中，雙縮尿與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮尿反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鏈，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮尿反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)。

方法特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：適合檢測(cè)總蛋白質(zhì)的含量，操作簡(jiǎn)單、測(cè)量速度快。

缺點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)必須使用代表性很強(qiáng)的樣品，需使用其他參考方法測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的蛋白質(zhì)總含量，故測(cè)定工作費(fèi)力費(fèi)時(shí)。不宜測(cè)定樣品種類(lèi)多、彼此差異大的樣品。

檢出限：測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定范圍為1-20mg蛋白質(zhì)。

干擾物：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

適用范圍：常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。

④Lowry 法

Lowry 法是雙縮脲法的發(fā)展，結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，是最靈敏的蛋白質(zhì)測(cè)定方法之一，在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，目前分為基本法和改良簡(jiǎn)易法，改良簡(jiǎn)易法可獲得與基本法相近的結(jié)果。

基本法實(shí)驗(yàn)原理：

顯色原理與雙縮尿法相同，但加入了Folin-酚酞試劑，以增加顯色量，從而提高檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：①在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。②Folin一酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高。

缺點(diǎn)：耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，操作時(shí)間需精-準(zhǔn)控制，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制麻煩，專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)比較多。

檢出限：可檢測(cè)的最-低蛋白質(zhì)量達(dá)5ug。通常測(cè)定范圍是20~250ug。

干擾物：酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等。

適用范圍：除蛋白含量測(cè)定，也可用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

⑤考馬斯亮藍(lán)法

實(shí)驗(yàn)原理：

考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最-大吸收峰的位置（max），由465mm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595mm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

方法特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度比Lowry高約4倍，高效率、檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便、只需要一種試劑，抗干擾能力強(qiáng)。

缺點(diǎn)：測(cè)定誤差大，不適用于不同蛋白的檢測(cè)。

檢出限：其最-低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1ug。

干擾物：干擾物質(zhì)少，但去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉、0.1N的NaOH會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法選擇

蛋白質(zhì)含量測(cè)定時(shí)，考慮以下因素后選定適用的檢測(cè)方法。

①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；

②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；

③溶液中存在的干擾物質(zhì)；

④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。

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