全部評論(3條)
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- 丿灬東赫銀塵丶 2010-11-30 00:00:00
- 原理就是膠體的帶電性,通電電時蛋白質向與它帶電性相反的一極運動,這就是電泳
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- sunrain2003 2010-11-30 00:00:00
- 不同蛋白質帶的電性和電量有所不同,因此可以通過電泳的方法分離。因為電泳能讓帶電粒子在電場中定向移動
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- 花朵朵的哆哆 2010-11-30 00:00:00
- 因為蛋白質是兩性物質 帶電荷 所以在電場中 帶正電荷的蛋白質向陰極移動 帶負電荷的蛋白質向陽極移動
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反相液相色譜(Reverse Phase Liquid Chromatography, RPLC)是一種基于疏水相互作用的高效分離技術,廣泛應用于蛋白質及多肽的分離、純化與分析。其核心原理在于固定相與流動相的極性差異,以及樣品分子與固定相之間的疏水分配效應。以下將從分離機制、蛋白質特異性行為、固定相與流動相選擇、應用場景等角度展開說明。
反相色譜的固定相通常由疏水性材料(如C18、C8或C4鍵合硅膠)構成,而流動相為極性溶劑(如水、甲醇或乙腈)。分離過程中,蛋白質的疏水區域與固定相發生非共價結合,極性較強的分子優先被流動相洗脫,疏水性更強的分子則因保留時間延長而實現分離。梯度洗脫是優化分離效果的關鍵手段,通過逐步增加有機溶劑比例削弱疏水作用,從而按疏水性差異依次洗脫目標分子。
蛋白質在反相色譜中的行為具有特殊性。由于流動相中常添加三氟乙酸(TFA)等離子對試劑,蛋白質可能發生部分去折疊,暴露出內部疏水殘基,增強與固定相的相互作用。此外,低濃度TFA可誘導蛋白質形成伸展構象,導致其在死時間前洗脫;而高濃度TFA通過形成離子對使蛋白質構象緊湊(如“熔融球體”),延長保留時間。這種構象敏感性使反相色譜不僅能分離蛋白質,還可用于研究其構象穩定性與表面疏水性。
固定相的選擇需綜合考慮蛋白質大小與疏水性。C18和C8適用于小分子肽段,而C4因較短的烷基鏈更適合大分子蛋白質,避免過度保留。流動相中,乙腈因低黏度和高洗脫能力成為首選有機溶劑,TFA則通過抑制硅醇基電離減少峰拖尾。梯度優化需平衡分辨率與時間成本,例如降低最大有機溶劑濃度可改善峰分離,但可能延長分析周期。
在應用層面,反相色譜憑借高分辨率與質譜兼容性,成為蛋白質組學研究的重要工具。其典型場景包括:多肽藥物的純度分析、酶解產物的肽圖繪制、翻譯后修飾(如磷酸化、糖基化)的檢測,以及蛋白質構象變化的動態監測。例如,與質譜聯用時,反相色譜可分離復雜肽段混合物,通過質譜鑒定實現蛋白質序列的高通量解析。此外,其在治療性抗體表征中的應用也日益增多,尤其在檢測聚集體與降解產物方面表現卓越。
操作參數的設置直接影響分離效能。流速需根據色譜柱內徑與填料粒徑調整,通常內徑4.6mm的C18柱推薦流速為1mL/min。壓力上限需控制在柱耐受范圍內(通常≤6000psi),以避免固定相塌陷。檢測方法方面,紫外檢測(280nm)依賴蛋白質中芳香族氨基酸的吸收,而質譜聯用可提供分子量及結構信息,靈敏度更高。
總之,反相液相色譜通過疏水相互作用與動態梯度洗脫,實現了蛋白質的高效分離與分析。其獨特的構象敏感性、靈活的固定相選擇及與質譜的兼容性,使其在生物醫藥與基礎研究中不可或缺。未來,隨著新型固定相(如表面多孔顆粒)與微流控技術的發展,反相色譜在蛋白質分析中的分辨率與通量將進一步提升。
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