細胞計數(shù)儀驗證

1．細胞計數(shù)儀概述

細胞計數(shù)儀是用來進行細胞濃度檢測的儀器，目的是為了明確培養(yǎng)的細胞在某一時間段的密度，及時補充營養(yǎng)液，以便其能夠良好生長，一般以每毫升細胞數(shù)（細胞/ml）來表示計數(shù)結(jié)果。那么這就需要測量死細胞和活細胞的濃度，在細胞中，細胞死亡是正常的，總細胞數(shù)中活細胞所占的百分比稱為細胞活力，也可叫做存活率。對細胞活力的應(yīng)用可用于對復(fù)蘇后細胞凍存和復(fù)蘇效果的檢測，也可用于在組織中對細胞進行分離時是否存在損傷的檢測。現(xiàn)在常用的對細胞死活的辨別方法是通過使用臺盼藍，臺盼藍染色的原理是活細胞不會被染色，而死細胞能夠染色，另一個是熒光染色法來鑒別。細胞計數(shù)儀有兩個重要的功能，一個是計數(shù)，另一個就是對細胞是否死亡的判斷。目前市場上有兩類細胞計數(shù)儀：一類是明場細胞計數(shù)儀僅需簡單的臺盼藍染色，另一類是熒光場細胞計數(shù)儀，需要相應(yīng)的熒光染料。

2．細胞計數(shù)儀的原理

(1)      臺盼藍染色原理（明場細胞計數(shù)儀）：臺盼藍是細胞跨膜染料，活細胞膜結(jié)構(gòu)完整，臺盼藍無法通過，細胞呈中心透亮具有明顯的輪廓。死細胞膜通透性改變，臺盼藍可跨過死細胞膜進入細胞內(nèi)，使細胞顏色加深，呈現(xiàn)實心的圓點與活細胞中心透亮輪廓清晰有明顯的差異，根據(jù)這種形態(tài)的差異可以明顯區(qū)別活細胞和死細胞進行區(qū)別計數(shù)。

(2)      AO/PI 熒光染色原理（暗場細胞計數(shù)儀）：AO/PI 為細胞核染料，AO 為吖啶橙是一種小分子染料，可以跨過所有細胞膜進入細胞內(nèi)，使有核細胞標(biāo)記上綠色熒光。PI 是碘化丙啶一種大分子染料，只有細胞死亡膜通透性改變后才能跨膜進入細胞內(nèi)，使死細胞的核標(biāo)記上紅色熒光。AO/PI 染細胞后，死細胞會同時染上 AO 和 PI，AO 的發(fā)射光波長 532 nm 左右，PI 的激發(fā)光波長剛好與 AO 發(fā)射光波長相重，兩種染料同染上死細胞核時會發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，AO 的發(fā)射光被 PI 吸收，所以死細胞只會顯示紅色熒光，而活細胞只有綠色熒光。因此，通過特異性染色的細胞上標(biāo)記的紅色熒光和綠色熒光就可以快速辨別出死細胞和活細胞。

注：AO/PI試劑由可以發(fā)出綠色熒光的DNA結(jié)合染料吖啶橙（AcridineOrange，簡稱AO）和可以發(fā)出紅色熒光的DNA結(jié)合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，簡稱PI）組成。

3．為什么細胞計數(shù)儀要做驗證呢？

首先應(yīng)該明確做驗證的目的，就是為了保證使用的儀器檢測出的結(jié)果數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可信。細胞計數(shù)儀是用來檢測細胞數(shù)目的儀器，對其準(zhǔn)確度要求很高，比如它的重復(fù)復(fù)現(xiàn)結(jié)果的能力、穩(wěn)定性等等。新儀器使用前以及儀器使用一段時間后都需要對其進行驗證，保證檢測細胞數(shù)目的結(jié)果準(zhǔn)確、可信，就必須對它的安裝、環(huán)境等各部分系統(tǒng)要求進行驗證，以證明該儀器符合檢測的目的和要求，產(chǎn)生的誤差也在規(guī)定范圍內(nèi)。那么儀器驗證就是對儀器各功能進行檢測、驗證使其滿足使用者的要求。這就需要通過設(shè)計合理的預(yù)試驗來驗證該儀器是否符合檢測樣品的規(guī)定要求，復(fù)現(xiàn)性怎么樣、準(zhǔn)確度會不會有偏移，結(jié)果是否可信等。所以儀器驗證就是為了保證所檢測出的結(jié)果是否可信、準(zhǔn)確，這是很有必要的，只有經(jīng)過驗證的儀器，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細胞數(shù)目的檢測。

4．細胞計數(shù)儀驗證項目

（1）安裝確認

a. 文件確認

b. 附件確認

c. 安裝環(huán)境確認

d. 安裝情況確認

（2）運行功能確認

a. 運行功能確認

b. 軟件控制功能測試

（3）性能確認

a. 準(zhǔn)確度測試

b. 線性關(guān)系測試

c. 重復(fù)性測試

d. 細胞活率判定測試

5．注意事項

(1)      每次使用前檢查檢出室或檢出器細孔是否被污染，檢出器細孔是否被損壞，細胞計數(shù)定量隔膜泵和檢出器之間的管道是否堵塞等；

(2)      取樣計數(shù)前，充分混勻細胞懸液，使分散成單個細胞；

(3)      如果感覺細胞數(shù)量較多時，可以從細胞懸液中吸取10μL至100μL，用少量PBS稀釋后再作計數(shù)；

(4)      上機前注意檢查是否有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中；

(5)      所用的稀釋器、吸樣管要經(jīng)過校準(zhǔn)；

(6)      檢測前試樣混勻很重要，如果無旋轉(zhuǎn)式混勻器應(yīng)顛倒混勻至少8次；

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華譜&澤恒是專注于為生物制藥行業(yè)提供實驗室儀器計量校準(zhǔn)、GMP驗證服務(wù)/3Q驗證/設(shè)備確認/廠房驗證的專業(yè)服務(wù)商。我們給制藥客戶解決的是一站式QC/QA/工程/驗證等事業(yè)部的質(zhì)控外包服務(wù)。

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