- 2025-01-21 09:29:54蛋白質和多肽
- 蛋白質和多肽都是生物體內重要的生物大分子。多肽是由多個氨基酸通過肽鍵連接而成的短鏈化合物，而蛋白質則是由多肽進一步折疊、組裝形成的復雜生物大分子。蛋白質和多肽在生物體中扮演著至關重要的角色，如酶催化、結構支持、信息傳遞、免疫防御等。它們是生命活動的基礎，對于維持生物體的正常生理功能具有重要意義。
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蛋白質和多肽問答
- 2019-06-25 09:06:03蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南十
- 蛋白質純化RP-HPLC 是一種有效的蛋白質/多肽純化工具。 通過 RP-HPLC 法可以從雜質中分離目標蛋白/多肽，采集到的片段可用于進一步研究，以及借助正交分析技術的分析，甚至可作為ZL藥物。 在蛋白質/多肽分析過程中，色譜條件優化的目標是優化分辨率和保留時間。 制備色譜法分離蛋白質/多肽時，色譜條件的開發主要是三個參數的優化（參見圖45）： 產量是從色譜法每一步中得到的純化的目標蛋白/多肽含量。高產量可提高純化過程的實用性，并降低成本。 純度是從目標產物中去除雜質的程度。純度高有助于從后續分析中獲得更佳的數據或獲得高純度產物。 通量用來衡量制備周期中純化的物質量。高通量說明在給定的成本和時間內獲得更多研究或分析用物質，或更多原料藥，用于制藥領域。 由于制備色譜的目的與分析色譜的目的不同，因此色譜條件優化也不同。 圖45. 在蛋白質或多肽的制備純化中，通過尋求產量、純度及通量的Z佳平衡實現分離條件的優化。 樣品裝載在分析色譜中，將小樣品裝載到色譜柱上以確保加樣量不影響分辨率。 如果樣品量過高，則峰會加寬，進而分辨率會下降。 在不發生峰展寬的情況下允許加載到色譜柱的樣品量（“樣品容量”）取決于柱的大?。ǜ戒浟斜盹@示了柱的大小和樣品容量）。 制備色譜法純化蛋白質/多肽時，通常會超出樣品容量，使柱“過載”，從而增加產量和通量（圖46）。 當允許一定的分辨率損失時，加載的樣品量可為樣品容量的10~50倍（附錄，Z大實際負載）。 圖46中，盡管由于柱過載使得峰變寬，但峰形相對較好，說明嚴重過載在增加產量的同時還能保持純度，但目標蛋白/多肽的損失不可避免。 由于樣品過載，圖47中峰也同樣加寬。 片段收集、分析和利用當柱過載時，通常會拋棄起始峰和結尾峰。 圖46中，對紅色區標示的峰的中間區域進行了收集。去掉了峰首和峰尾。 這避免了分離度較差的雜質峰的收集，增加了純度，但降低了產量。 在制備色譜中，對幾種感興趣的峰進行了片段收集，用于雜質分析。 圖46.在多肽純化示例中，制備分離包括柱的過載加樣，以增加產量。 分辨率降低，為了增加純度必須拋棄峰首和峰尾，但產量稍微有所降低。 基于分析結果，收集了少雜質或無雜質的片段，拋棄了峰首和峰尾附近雜質較多的片段。 收集和拋棄片段的選擇應考慮純度和產量的平衡。 例如，在不損失分辨率的情況下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于純化少量多肽（Z多約200微克）。 但為了增加產量和通量，同樣大小的柱Z多可純化10毫克，但會有一定的純度或產量損失。 恰當的收集峰選擇有助于實現純度和產量間的Z佳平衡。 在制備色譜中，盡管ZD在樣品質量，但樣品體積也可能會很大。 盡管可采用樣品環和注射器，但通過將樣品“泵”至柱上可以注入更多樣品。 將泵的吸入管置于樣品容器內，樣品通過洗脫泵加載至色譜柱。 當有機溶劑濃度低（通常，樣品裝在水相中）且目的蛋白/多肽以有機溶劑梯度洗脫時，可通過這種方式裝入大量樣品。 吸附劑粒徑分析色譜常用的吸附劑粒徑為5μm，制備色譜常用的吸附劑粒徑更大。 尤其是加樣量超過樣品容量時（柱過載），柱效較分析色譜影響較小。 當柱過載時，大粒徑填充柱同小粒徑填充柱分離蛋白質和多肽的效果一樣。 因此，制備色譜常用10μm或以上粒徑的吸附劑。粒徑分布也往往更寬。 不同于0.5μm或更窄的粒徑分布范圍，制備色譜的粒徑范圍更大，例如10~15μm。 由于制備色譜柱反壓和成本更低，因此更傾向于采用大粒子。 柱內徑由于樣品容量很低，純化過程很少使用小孔柱（內徑小于2mm）。 小規模實驗室純化采用細孔柱（內徑約2mm）和分析柱（4.6 mm內徑）。 這種小規模制備分離的色譜條件通常與分析分離的色譜條件相同。 需要大量蛋白質/多肽時，采用10mm和22mm內徑的柱子。1 mg蛋白質或多肽的純化可采用10 mm柱子，5 mg純化可采用22 mm柱子。 允許柱過載時，可純化更多蛋白質/多肽，10mm柱Z多可純化50mg，22mm柱Z多可純化200mg。 大量蛋白質或多肽的純化采用50 mm、100 mm或內徑更大的大內徑柱子。50mm內徑的柱上已知Z多可純化5克蛋白質/多肽。 柱長與分析柱相比，制備柱往往相對較短。 這是因為在制備色譜法中，柱的總體積比柱長更重要，特別是蛋白質的分離。 內徑60cm、柱長12-15 cm（“圓餅狀”柱）的色譜柱已應用到蛋白質ZL藥物的大規模純化中。 由于在制備色譜法中，柱通常過載，且效益的重要性遠不及產量、純度及通量重要，因此根據其實用性而非效益優化柱尺寸。 流動相組成同分析色譜法一樣，采用10~22mm內徑柱的小規模純化常用乙腈-TFA體系。 大規模純化通常采用乙醇等溶劑替代乙腈，采用乙酸替代TFA。 盡管采用這些溶劑作流動相會降低分辨率，但它們更適合大規模使用，且分辨率的降低與柱過載固有的分辨率損失相同 蛋白質變性通常認為反相色譜法會使蛋白質變性，因此洗脫出來的蛋白質不是天然蛋白，且可能不具備生物活性。 盡管反相HPLC的操作條件會使蛋白質變性，但洗脫后仍可獲得天然、具有生物活性的蛋白質。 有機溶劑可能減弱疏水力，造成蛋白質三級結構的損失。吸附劑的疏水面也可能導致蛋白質的去折疊。 但與色譜分離時間相比，蛋白質去折疊通常較慢，且蛋白質在反相色譜分離期間僅發生輕微變性。 由于二硫鍵的作用，蛋白質保持球形結構，且僅發生部分去折疊，因此從反相柱洗脫出的蛋白質通?？赏ㄟ^在恰當的重折疊緩沖液中處理，從而恢復其天然結構而恢復至天然狀態。 目前有許多實例均顯示采用反相HPLC純化后的蛋白仍維持天然三級結構和生物活性。 胰蛋白酶的反相純化，其中活性得到了保留，且隨后用于蛋白質的胰蛋白酶酶切。 重組人紅細胞生成素是一種成功商業化的蛋白質ZL藥物，采用了反相GX液相色譜法將蛋白藥物從其細胞培養表達系統中分離出來。 采用反相HPLC對另一種商業蛋白質ZL藥物——粒細胞刺激因子進行了純化。 此外，還采用反相HPLC對重組人胰島素進行了純化，維持了活性結構。 純化實例圖47顯示了合成肽——促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑的純化過程。該純化過程通過以下幾個步驟展開： 在4.6 x 250 mm 的分析柱上構建洗脫條件。 在50 x 300 mm 的柱上裝載1.2克合成肽混合物，基于diyi步構建的條件洗脫（圖47）。 對 GnRH 拮抗劑各洗脫峰的片段進行收集并借助分析法分析，Z終實現Z高產量和純度。 用乙腈和TFA作為洗脫劑，在反相色譜柱上再次進行色譜分析,完成收集到片段的脫鹽處理。 收集片段實現Z高產量和純度。 在該色譜純化步驟中，從1.2 gm的反應混合液中可收集128 mg的純化肽。 該純化過程采用了與分析色譜分離相同的有機溶劑——乙腈，但采用磷酸三乙胺替代了TFA。 由于柱過載，洗脫峰更寬，分辨率不如分析色譜。但峰仍然較為緊密，且容易收集到含目的多肽和GnRH的洗脫液。 圖47. 128mg的合成肽——促性腺激素釋放激素的純化。 柱嚴重過載，導致峰非常寬。 條件 色譜柱：C18寬孔柱，15~20μm粒徑，50 x 300 mm。 流動相：乙腈和磷酸三乙胺水溶液梯度洗脫。 樣品：促性腺激素釋放激素
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- 2019-06-24 09:01:16蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南九
- 二硫鍵測定蛋白質依靠正確的二硫鍵鍵合維持其三級結構和生物活性。 如果二硫鍵被還原或交換，則蛋白質會失去天然三級結構和生物活性。 HPLC保留值取決于蛋白質“疏水腳”的大小（圖41），它會受到三級結構的影響。 二硫鍵的改變通常會使“疏水腳”增大，從而使蛋白質在反相HPLC中的保留值增大。 圖42中，天然白細胞介素II的出峰遠遠早于被還原的白細胞介素II，這是由于當二硫鍵被還原時，蛋白質的三級結構發生了改變。 圖41. 蛋白質保留值取決于“疏水腳”的大小。被還原的二硫鍵會使蛋白結構發生部分變性，這將增大“疏水腳”和反相保留值。圖42. 隨著二硫鍵的還原，白細胞介素II的“疏水腳”會增大，從而增加蛋白質在反相HPLC上的保留值。條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動相：44.5%~50.8% 乙腈，以2 ml/min的流速進行90分鐘的梯度洗脫樣品：白細胞介素II突變蛋白質圖43. 對二硫鍵合正常和發生二硫鍵交換的類胰島素生長因子的分離。條件色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動相：20~38% 乙腈：異丙醇（88:12）—0.1% TFA體系，梯度洗脫，27分鐘。 即使是細微的二硫鍵改變也足以對疏水腳產生影響，從而改變保留值。 天然類胰島素生長因子（IGF）的Cys52和Cys47以及Cys48和Cys6之間都有二硫鍵（圖43A紅色部分所示）。 經過36小時的空氣氧化，一些IGF蛋白分子內出現了二硫鍵交換，變成了Cys52和Cys48以及Cys47和Cys6間的二硫鍵鍵合（圖43A藍色部分）。 發生了二硫鍵交換的IGF比天然IGF出峰晚（圖43），表明了疏水腳的增大。 天然蛋白的反相色譜法通常以反相保留值的變化揭示二硫鍵或蛋白三級結構的改變。在蛋白酶水解蛋白過程中（通過省去DTT和羧甲基化過程），如果二硫鍵未被還原，則肽圖中仍會包含二硫鍵合的二肽。 分別比較二硫鍵未還原和還原的肽圖能夠確定二硫鍵的位置。 在二硫鍵還原和未還原條件下水解白細胞介素II，通過RP-HPLC法得到兩種水解產物的肽圖（圖44）。 圖44A中，以T7+T10標記出的肽是一種二硫鍵合的二肽。 在二硫鍵被還原的條件下得到的肽圖顯示了兩種肽，分別為T7和T10（圖44B）。 這證實了二硫鍵存在于這兩種肽之間。 監測蛋白質水解產物肽能夠確定各個二硫鍵在蛋白質中的位置。 如果一個胰蛋白酶肽段內存在兩個半胱氨酸，則必須利用另一種蛋白酶確定參與到二硫鍵中的半胱氨酸。通常將肽圖分析和質譜法聯用確定二硫鍵的位置和狀態。 圖44. 分別比較二硫鍵未還原（A圖）和還原（B圖）情況下白細胞介素II的肽圖。條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動相：5~80% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，99分鐘。樣品：A二硫鍵未還原情況下白細胞介素II的肽圖。B二硫鍵還原情況下白細胞介素II的肽圖。
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- 2019-06-21 09:25:19蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南八
- 脫酰胺作用 - 蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南蛋白質在高溫或高pH值下會降解。 在脅迫條件下，Z有可能發生的化學降解是酰胺側鏈上的天冬酰胺轉變為天冬氨酸或異天冬氨酸（圖37)。 天冬酰胺脫去酰氨基時，許多蛋白都會失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影響。 即使脫酰胺作用不造成生物活性的減弱，脫酰胺作用也是蛋白接觸不利條件的指示。 特定天冬酰胺殘基脫酰胺的可能性取決于其在蛋白質三級結構中的位置。 只有那些與溶劑接觸表面接近的天冬酰胺殘基才會發生脫酰胺作用。 相鄰的氨基酸殘基同樣影響脫酰胺作用的可能性。與天冬酰胺相鄰的甘氨酸極大地增加了脫酰胺作用的可能性。 與天冬酰胺相鄰的亮氨酸和異亮氨酸等大分子疏水性氨基酸降低了脫酰胺作用的可能性。 由于脫酰胺作用會影響生物活性并能指示不利條件，因此慣常的做法是監測蛋白質ZL藥物中天冬酰胺的脫酰胺作用。 圖37. 當酰胺側鏈暴露在高溫和/或高pH條件下時，天冬酰胺轉化為天冬氨酸。 圖38. 人生長激素脫酰胺作用的反相色譜分析條件色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動相：29% 異丙醇，71% 10 mM Tris鹽酸緩沖液、pH=7.5這通常由反相GX液相色譜法實現。 圖38顯示了通過完整蛋白分子的反相色譜法測量人生長激素的脫酰胺作用的一個試驗。 該試驗pH為7.5，以使脫酰胺作用產生的天冬氨酸電離。 這使得脫酰胺的生長激素相較于天然蛋白疏水性減弱，從而比天然蛋白先洗脫出來。更常見的一種方法是通過肽圖中含天冬酰胺/天冬氨酸多肽的保留時間來測定脫酰胺作用。 在pH為2的肽圖中，含有天冬氨酸的脫酰胺肽的疏水性比含天冬酰胺的天然肽略強，因此比天然肽略晚洗脫出來，如圖39所示。 脫酰胺肽容易鑒別測定，為脫酰胺作用的判定提供了較好的方法。圖39. 部分脫酰胺的核糖核酸酶的肽圖條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動相：5%~38% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，100分鐘。有時，脫酰胺肽較難從天然肽中分離或會在肽圖中出現與其它肽的共洗脫峰。 如果分辨率不足，則可以增加pH。 如圖40所示，在低pH值下分離較差的脫酰胺肽能夠在6.5的高PH值下從天然肽中有效分離。 在部分脫酰胺的人生長激素的低pH肽圖中（圖40A），脫酰胺肽出峰稍晚于天然肽，但與肽圖中的另一種肽未分離。 對肽峰進行收集后以更高的pH（pH6.5）重新進行色譜分離。在高pH值下，脫酰胺肽中的天冬氨酸被電離，出峰早于含天冬酰胺的天然肽，且峰形好（圖40B）。圖40. 部分脫酰胺的人生長激素的肽圖中脫酰胺肽從天然肽的分離。A pH=2時，部分脫酰胺的hGH的肽圖（0.1% TFA）B 收集含天然肽（頂部）和脫酰胺肽（底部）的肽圖A中的肽段，在6.5的pH下重新進行色譜分析。色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米A. 流動相：乙腈-0.1% TFA體系梯度洗脫，pH 2.0B. 流動相：乙腈-30 mM 磷酸鈉體系梯度洗脫，pH 6.5
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- 2019-06-20 09:33:10蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南七
- 蛋白質氧化 - 蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南在氧化環境條件下，盡管蛋白質的幾個氨基酸都可能受影響，但Z有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亞砜（圖34）。 對甲硫氨酸殘基的氧化取決于其在蛋白質中的位置。埋藏在蛋白質內部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且與溶劑接觸的甲硫氨酸側鏈Z有可能被氧化。 氧化條件包括熱、過渡金屬的存在以及溶液中氧氣的存在。 同脫酰胺作用一樣，甲硫氨酸的氧化可能導致生物活性的喪失或減弱，或者，在一些情況下對生物活性無影響。 這取決于甲硫氨酸在蛋白質中的位置。但另一方面，甲硫氨酸亞砜的存在說明蛋白質經受過氧化條件，因此甲硫氨酸氧化可以指示蛋白質經受過脅迫條件。 圖34. 在氧化環境條件下，甲硫氨酸被氧化為甲硫氨酸亞砜。 圖35. 天然蛋白水解產生的重組人凝血因子VIIa的一氧化物和二氧化物的反相色譜法分離。 條件色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米流動相：37~47% 乙腈-0.1% TFA體系，30分鐘梯度洗脫。樣品：被過氧化氫部分氧化的重組人凝血因子 VIIa。通常會監測蛋白質ZL藥物的氧化反應，因為它既可能影響生物活性，也可作為一種指示。 甲硫氨酸的氧化反應會導致蛋白質疏水性下降，因此在反相HPLC中，氧化蛋白會先于天然蛋白洗脫出來，如圖35所示。 重組人凝血因子VIIa（rCF VIIa）被過氧化氫部分氧化后利用反相HPLC對溶液進行分析。 氧化蛋白（兩個甲硫氨酸殘基被氧化）先洗脫出來。 只有一個甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白隨后洗脫出來，Z后是天然蛋白。四種蛋白具有良好的分辨率。 尤其是只有一個甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白間分辨率很高。這幾種蛋白均有一個氧化甲硫氨酸，僅區別于被氧化甲硫氨酸的不同。通常利用肽圖監測甲硫氨酸的氧化。 如圖36所示，含氧化甲硫氨酸的多肽比含天然甲硫氨酸的多肽出峰時間早很多。T2 metox 先于天然T2胰蛋白酶水解片段洗脫出來；T11 metox先于天然 T11洗脫出來，使得鑒別和監測更容易。圖36. 部分氧化的人生長激素的肽圖。 條件色譜柱：C18寬孔柱，4.6 x 250 mm流動相：0~40% 乙腈—0.1% TFA體系，梯度洗脫，120分鐘。
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- 2019-06-19 15:32:41蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南六
- 肽圖分析法 - 蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南反相GX液相色譜已成為蛋白質分析和表征的標準方法，尤其是ZL性藥物的分析和表征。 反相色譜分析法分辨率高，檢測靈敏度好，能夠提供大量關于蛋白質的信息。 有些時候，蛋白質作為完整的分子分析，但更多的時候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸殘基將碳骨架斷開，從而將蛋白質裂解成小片段。 隨后用反相GX液相色譜法對裂解產生的肽段進行分析。 該技術叫作肽圖分析，是一種標準的蛋白質分析方法。通過反相色譜分析蛋白質裂解后的肽段能夠獲得蛋白質的大量信息。通過比較表達蛋白與參照標準蛋白的肽圖能夠得出蛋白純度和表達的準確性。肽圖通常作為蛋白質ZL藥物的鑒定分析工具。 通過肽圖可以確定蛋白質降解產物，如發生脫酰胺作用的天冬酰胺和氧化甲硫氨酸。肽圖可以確認或驗證二硫鍵連接，以此得出蛋白質三級結構和LX。肽圖能夠確定糖基化（加入碳水化合物）位點，為詳細鑒定連接在其上的寡糖提供了條件。利用質譜檢測得到的肽圖為蛋白質鑒定、肽序列分析和數據確認提供了一種先進的手段。在生物蛋白質組研究中，蛋白酶水解產物還用于蛋白質的鑒定和定量分析。 有許多蛋白水解酶都能斷開蛋白質的碳骨架，通常作用于特殊氨基酸殘基。包括： 蛋白酶特異性特性胰蛋白酶作用于賴氨酸和精氨酸的羧基端平均每10~12個氨基酸產生一個肽。胰蛋白酶是Z常用的蛋白水解酶。胞內蛋白酶 Lys-C作用于賴氨酸的羧基端能夠產生胰蛋白酶水解蛋白生成多肽的60~70%。Lys-C 的優點是在高達4M的尿素濃度中仍能保持活性。S.aureus V8 蛋白酶作用于酸性氨基酸和天冬氨酸的羧基端。為胰蛋白酶水解法提供補充信息。胞內蛋白酶 Asp-N作用于天冬氨酸的羧基端為胰蛋白酶水解法提供補充信息。 胰蛋白酶是Z常用的蛋白水解酶（蛋白酶）。以下為胰蛋白酶水解蛋白的五個階段：（注：參考文獻21詳細回顧了胰蛋白酶的水解） 變性。要在合理的時間內完成蛋白質水解，必須對蛋白質作變性處理。高溫下（37℃），將蛋白質置于6M 鹽酸胍或8M 尿素等離液劑中，在中性pH值（~7.5）緩沖液下處理30分鐘，蛋白質即可變性。二硫鍵的還原。二硫鍵會阻止蛋白質的完全變性。 通常可通過在待水解蛋白的變性過程中加入濃度為~20 mM 的二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑將二硫鍵還原。游離半胱氨酸的羧甲基化。如果還原性半胱氨酸保持游離狀態，則有可能以錯誤的方式重新形成二硫鍵。為了避免這種情況，可加入濃度為~60mM的碘乙酸等試劑，在37℃溫度下處理30分鐘，使游離半胱氨酸甲基化。該反應由100 mM DTT 退火。脫鹽。當溶液中存在尿素或胍鹽時，水解反應無法進行，因為胰蛋白酶自身作為一種蛋白質會變性，失去酶活性。 尿素或胍鹽必須通過離子交換或滲析去除或將濃度降低至1M以下。胰蛋白酶水解。脫鹽后，將蛋白質溶解在pH7.5~8.5（胰蛋白酶的Z高活性pH）的緩沖液中——Tris或碳酸銨，并在20~100個待水解蛋白組分中加入一份胰蛋白酶，隨后在低溫至37℃的溫度區間內處理蛋白質。 低溫處理時間長達16個小時。在37℃下，水解可在1~4小時內完成，具體取決于蛋白質。如果胰蛋白酶的時間、溫度或相對濃度均過低，則水解將不完全，一些潛在裂解可能不發生，Z終導致形成含賴氨酸或精氨酸的大分子肽。 如果胰蛋白酶的水解時間、溫度或濃度均過高，則會發生胰蛋白酶自身溶解，產生“自溶產物”，即胰蛋白酶水解產生的肽段，從而造成混淆。 慣常的做法是忽略蛋白質，考慮胰蛋白酶。按照蛋白質完全水解的條件對得到的樣品進行色譜分析，了解胰蛋白酶自溶的程度以及肽圖中任何胰蛋白酶自溶肽產物的位置。 開發胰蛋白酶水解協議過程中，對胰蛋白酶和蛋白質的水解時間、溫度和相對濃度進行了優化。當利用肽圖確定二硫鍵的位置時，必須在不還原二硫鍵的情況下水解蛋白。但在二硫鍵未被還原的情況下，許多蛋白質的水解速度非常慢。在缺還原劑的情況下，如果水解速度很慢或水解不佳，可利用Lys-C代替胰蛋白酶，并在4M尿素中水解，維持水解過程中蛋白質的變性。 水解過程中有時采用表面活性劑維持溶液中的蛋白質，但表面活性劑會降低色譜分辨率，應盡量避免。 胰蛋白酶水解分析。蛋白質水解產生的肽段利用反相GX液相色譜分析，流動相采用含TFA體系（參見第15-17頁），以起始濃度約5%的乙腈梯度洗脫（乙腈起始濃度低于5%可能導致較早洗脫出肽的色譜的不可重現性），乙腈濃度逐漸升至70%（參見圖31）。 梯度洗脫的時間取決于待水解蛋白的大小。 大分子蛋白比小分子蛋白水解產生更多的肽段，因此肽段的分離需要更長洗脫時間。 小分子蛋白（小于20kd）水解產生的肽通常可在45~60分鐘內完成分離。 大分子蛋白（20-50kd）需要較長的洗脫時間，一般為60~120分鐘。 分子量大于50kd的蛋白質需要120~180分鐘的洗脫時間。 采用1~2 ml/min 的流速和適宜的溫度時分辨率Z佳。通常采用C18 反相柱?？梢允褂每讖綖?00?；?00埃的柱子，其選擇性通常不同。圖31. 牛血清白蛋白的肽圖 色譜柱：ACE 5 C18-300 寬孔柱，4.6 x 150 mm 流動相：4%~70%乙腈-0.1% TFA 體系，混合梯度洗脫120分鐘。 蛋白質修飾引起肽保留時間的變化。如果蛋白質因翻譯或表達錯誤，降解（脫酰胺作用、氧化反應）或過程變異而改變，則這種改變將會反映在一種或多種肽段。 由于與肽的反相相互作用的靈敏度，肽的任何變化都將導致該肽保留時間的變化。 在圖32示例中，相差一個氨基酸的兩種十肽，其中一個為蘇氨酸，另一個為絲氨酸，在反相HPLC圖譜中出現了兩個峰。 不僅僅是一個氨基酸的差別，而且兩種氨基酸均為羥基氨基酸，它們的不同之處在于蘇氨酸側鏈上加了一個甲基。 這說明了蛋白質的任何變化都會反映為肽的變化，從而導致該肽保留時間的改變。 肽圖分析的本質是反相HPLC能夠實現差別細微的多肽的分離。圖32. 以RP-HPLC對緊密關聯的肽類進行分離。 僅有一個氨基酸不同的兩種十肽菌素，一種含絲氨酸，而另一種含蘇氨酸。條件色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米洗脫液：A. 含有0.1%三氟乙酸的水溶液B. 含有0.08%三氟乙酸的乙腈溶液梯度：0 - 35%的B溶液超過73分鐘 試樣肽圖與參照蛋白質肽圖的比較。肽圖能夠提供有關蛋白質的很多信息。 慣常做法是對試樣的肽圖和參照蛋白質的肽圖進行比較。 圖33對重組人生長激素（在大腸桿菌中表達）的肽圖和天然人生長激素（缺乏甲硫氨酸）的肽圖進行了比較。 由于甲硫氨酸的疏水性質，重組人生長激素比天然人生長激素較晚洗脫出來。 在這個例子中，為了便于比較，將第二幅圖譜倒置顯示。 在一些情況下，為了確認微小的變化和證明分析工具與肽圖的變化無關，會將兩種水解產物混合進行色譜分析。肽圖比較揭示了蛋白質的改變和修飾，如：基因改變、翻譯錯誤、蛋白降解（脫酰胺作用、氧化反應），以及翻譯后修飾的改變。圖33. 重組人生長激素和天然人生長激素（缺乏甲硫氨酸）肽圖的比較。條件：色譜柱：C18寬孔柱，4.6 x 150 mm流動相：0~70% 乙腈-0.1% TFA 體系梯度洗脫
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