熒光顯微鏡是一種利用熒光的成像技術(shù)，通過內(nèi)在發(fā)射或人工添加熒光團(tuán)，以提供與顯微鏡圖像的對(duì)比。在生物醫(yī)學(xué)成像中，由于使用多種熒光標(biāo)記，不同的熒光團(tuán)可用于同時(shí)識(shí)別特定的目標(biāo)分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提供高度的特異性和選擇性。在材料科學(xué)中，熒光(光致發(fā)光)顯微鏡可以用來觀察發(fā)光納米粒子和半導(dǎo)體表面缺陷的圖像。

Fig. 1 Composite Widefield fluorescence image of bovine pulmonary artery endothelial (BPAE) cells acquired using the FS5 Spectrofluorometer with microscope add-on.

熒光顯微鏡可以獲取詳細(xì)的細(xì)胞圖像，如圖1所示的牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮(BPAE)細(xì)胞。BPAE細(xì)胞含有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme, ACE)，它是通過收縮和擴(kuò)張血管來調(diào)節(jié)血壓的重要成分。在這個(gè)BPAE樣品中，不同的細(xì)胞成分被用不同顏色的熒光染料標(biāo)記，以便觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。本文將詳細(xì)說明使用愛丁堡儀器FS5熒光光譜儀和顯微鏡附件獲得像上述BPAE的熒光圖像，以及發(fā)射光譜和壽命衰減光譜。

實(shí)驗(yàn)部分

樣品來自Invitrogen公司的FluoCells?制備的玻片#1，其中含有牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮(BPAE)細(xì)胞。BPAE細(xì)胞用不同的熒光染料的染色標(biāo)記，不同染料針對(duì)細(xì)胞中的特定結(jié)構(gòu)。MitoTracker?Red CMXRos標(biāo)記線粒體（紅色），Alexa Fluor?488 phalloidin用于標(biāo)記絲狀肌動(dòng)蛋白（綠色），DAPI用于標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色）。

Fig. 2 FS5 Spectrofluorometer coupled to a fluorescence microscope.

文中所有的測試使用愛丁堡儀器FS5熒光光譜儀與尼康Ni-U正置熒光顯微鏡耦合實(shí)現(xiàn)。FS5通過裝載液體光導(dǎo)臺(tái)，激發(fā)和發(fā)射光通過液體光導(dǎo)與顯微鏡耦合。FS5配置穩(wěn)態(tài)激發(fā)的150W氙燈， TCSPC壽命模塊，及電制冷PMT-980探測器。該實(shí)驗(yàn)中的顯微鏡配置CMOS熒光成像相機(jī)進(jìn)行寬場視野的熒光成像，激發(fā)和發(fā)射側(cè)光譜液體光導(dǎo)耦合接口，以及用于耦合愛丁堡皮秒脈沖激光器EPL-37的激光器耦合接口。

測試結(jié)果

熒光寬場成像圖 

為了獲得BPAE細(xì)胞的寬場熒光圖像，將FS5和顯微鏡進(jìn)行耦聯(lián)。激發(fā)光源為FS5的150 W穩(wěn)態(tài)Xe燈，使用SC-50光導(dǎo)樣品臺(tái)將激發(fā)單色器選擇的所需波長導(dǎo)入至激發(fā)側(cè)液體光導(dǎo)。激發(fā)光通過寬場激發(fā)耦合接口進(jìn)入顯微鏡中，進(jìn)入二向色片和物鏡中進(jìn)行樣品的激發(fā)。樣品的熒光信號(hào)通過物鏡采集及透過二向色片，通過發(fā)射帶通濾光片選擇所需的熒光波長，并使用CMOS相機(jī)進(jìn)行成像。

BPAE細(xì)胞用三種不同顏色的熒光染料標(biāo)記，以顯示細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器。為了獲得細(xì)胞的完整圖像，使用不同的激發(fā)波長、二向色片和針對(duì)每種染料優(yōu)化的帶通濾光片獲得了三張BPAE的獨(dú)立圖像。

Fig. 3 Widefield fluorescence image of bovine pulmonary artery endothelial (BPAE) cells. a) Green emitting filamentous F-actin, λex = 480nm with a 520±14 nm emission bandpass. b) Red emitting mitochondria, λex = 580nm with a 641±38 nm emission bandpass. c) Blue emitting nuclei, λex = 380nm with a 447±35 nm emission bandpass. d) Composite image of BPAE (combination of images a, b and c)

圖3a - 3c分別為Alexa Fluor?488標(biāo)記的絲狀肌動(dòng)蛋白、MitoTracker?Red CMXRos標(biāo)記的線粒體和DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核的單獨(dú)寬場熒光圖像。然后將這些單獨(dú)的圖像進(jìn)行組合，形成如圖3d所示的復(fù)合圖像，顯示出完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

FS5的氙燈和激發(fā)單色器提供了從200到1000 nm的可調(diào)諧的激發(fā)光源;與傳統(tǒng)顯微鏡中基于濾光片的激發(fā)源波長選擇相比，具有更大的波長選擇及靈活性。激發(fā)單色器與液體光導(dǎo)耦合避免了白光燈源作為熒光顯微鏡光源時(shí)常見的缺點(diǎn);如需要對(duì)燈源校正或者光源熱量破壞樣品。 

熒光光譜 

通過使用FS5將熒光重新定位至發(fā)射測液體光導(dǎo)中進(jìn)行檢測，測量BPAE細(xì)胞的熒光發(fā)射光譜。使用這種方法，在380 nm處激發(fā)BPAE細(xì)胞細(xì)胞核中的DNA結(jié)合的染料DAPI，獲得如圖4所示的熒光光譜。

Fig.4 Fluorescence spectrum of DNA-bonded DAPI. 

熒光壽命 

耦合熒光顯微鏡的FS5也可用于獲取標(biāo)記BPAE細(xì)胞的熒光壽命。對(duì)于熒光壽命測量，使用激光激發(fā)耦合器將脈沖二極管激光源安裝在顯微鏡上，相機(jī)和顯微鏡樣品臺(tái)用于將激光束聚焦到樣品中的特定關(guān)注的樣品測試點(diǎn)。使用FS5的發(fā)射單色儀選擇所需的發(fā)射波長，并使用TCSPC獲取熒光衰減。利用EPL-375脈沖二極管激發(fā)細(xì)胞核內(nèi)dna鍵合DAPI, TCSPC在460 nm處獲得的熒光衰減如圖5所示。壽命衰減曲線使用FS5的Fluoracle?操作軟件進(jìn)行擬合，顯示平均壽命為1.85 ns。

Fig.5 Fluorescence decay of DNA-bonded DAPI acquired using TCSPC.

結(jié)論

使用FS5熒光光譜儀與顯微鏡耦合觀察熒光標(biāo)記的BPAE細(xì)胞。以FS5氙燈為連續(xù)激發(fā)源，獲得細(xì)胞的寬場視野的熒光圖像，揭示細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和特征。通過測量熒光標(biāo)記的熒光光譜和壽命，進(jìn)一步了解熒光標(biāo)記的性質(zhì)。本文突出了FS5在搭載顯微附件時(shí)時(shí)的測量通用性及靈活性; 能夠輕松獲得圖像，光譜和壽命信息。