DNA合成反轉(zhuǎn)錄介紹和應(yīng)用
反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription，RT-PCR）又叫做逆轉(zhuǎn)錄PCR。將組織或細(xì)胞中的總RNA提取出來，模板使用其中的mRNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶，采用隨機(jī)引物或Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，模板再使用cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增來對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，或者使目的基因獲得。
介紹
特異性引物
引物使用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸是Z為特異的引發(fā)方法。如果兩種特異性引物為PCR反應(yīng)所使用，利用與mRNA 3’端Z靠近的配對(duì)引物作為第yi條鏈的合成的起始。用此類引物只會(huì)有所需要的cDNA產(chǎn)生，使得PCR擴(kuò)增更為特異。
隨機(jī)六聚體引物
當(dāng)有可以使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列在特定mRNA時(shí)，從而使得對(duì)其全長序列進(jìn)行復(fù)制很困難，全長mRNA的復(fù)制能夠通過隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來進(jìn)行。當(dāng)使用該方法時(shí)，全部cDNA第yi鏈模板由體系中所有RNA分子所充當(dāng)，在擴(kuò)增過程中，所需要的特異性賦予給了PCR引物。rRNA一般作為用此引物合成的cDNA的96%的來源。
Oligo(dT)
為一種對(duì)mRNA特異的方法。由于3’端Poly(A )尾為絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA所具有，當(dāng)其配對(duì)Oligo(dT)的時(shí)候，只能夠轉(zhuǎn)錄mRNA。因?yàn)樵诳俁NA中，Poly(A )RNA只有1-4%的比例，所以和隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA相比較，此種引物合成的cDNA得到更少的數(shù)量和更為簡單。
1、嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：
在存在Mn2下，高溫反轉(zhuǎn)錄RNA被允許，用來對(duì)RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行消除。
2、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：
和其它酶相比較，更大部分的RNA能夠由此種酶被轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性為從不易低溫反轉(zhuǎn)錄、含二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA模板使較長cDNA合成所允許。
3、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：
37℃是Z合適的作用溫度，有著相對(duì)比較弱的RNA酶H活性，聚合酶活性比較強(qiáng)。
4、 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：
42℃是Z合適的作用溫度，RNA酶H活性和聚合酶活性都比較強(qiáng)。
應(yīng)用
RNA檢測(cè)的靈敏性由于RT-PCR提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，提供了一些可能性對(duì)于分析一些極為微量RNA樣品。RNAGX轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的構(gòu)建、cDNA探針的合成、目的基因的獲取以及基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析為該技術(shù)的應(yīng)用
RT- PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是結(jié)合了cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）和RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)有著廣泛的用途并且非常的靈敏。能夠被用來對(duì)特定基因的cDNA序列直接克隆以及對(duì)細(xì)胞中RNA病毒的含量和細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)等。
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