維生素是維持人體生命活動所必需的一類營養(yǎng)物質(zhì)，大多數(shù)由食物供給，屬于人體內(nèi)的一類調(diào)節(jié)物質(zhì)。維生素分為水溶維生素和脂溶維生素，脂溶性維生素是不溶于水而溶于脂類的一類維生素，在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，包含維生素A、維生素D、維生素E和維生素K。

VD在肝臟可轉(zhuǎn)化為25羥基維生素D(25OH-VD)，其濃度水平與體內(nèi)的VD直接相關(guān)，因此體內(nèi)25OH-VD2、25OH-VD3可作為檢測VD水平的生物標(biāo)志物。VK是激活凝血因子以及蛋白質(zhì)C和S的必須輔助因子，目前已知主要有K1、K2、K3、K4幾種形式，四烯甲萘醌VK2(MK4)既是VK2的家族成員，也是肝外組織中K1的代謝物。當(dāng)這些脂溶性維生素缺乏或過量時均會對人體造成傷害。具體見下表：

一次性評估體內(nèi)多種維生素水平，才能全面“查漏補(bǔ)缺”。準(zhǔn)確測定人體中性維生素的含量，可以幫助臨床醫(yī)生準(zhǔn)確評估人體維生素營養(yǎng)狀態(tài)、吸收障礙或毒性水平。

解決方案

沃特世團(tuán)隊依托質(zhì)譜平臺ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD和 TQ-XS IVD開發(fā)了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)在維生素檢測中的應(yīng)用，在5 min內(nèi)即可完成6種脂溶性維生素的同時分析。前處理采用Andrew Alliance機(jī)器人搭配Oasis μElution PRiME HLB的固相萃取板，實現(xiàn)樣本前處理自動化，并解決LC-MS/MS檢測維生素的各種挑戰(zhàn)和難點(diǎn)。該方法檢出限低、分離效果好、穩(wěn)定性佳，可滿足臨床高通量自動化檢測需求。

圖1. Andrew+移液機(jī)器人用于6種脂溶性維生素前處理操作時的工作臺布局，以及ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-XS IVD檢測平臺。

實驗部分

 前處理

• 樣本預(yù)處理：取100 μL 血清或者BSA稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，加入內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻，隨后加入乙腈沉淀蛋白，離心取上清液，做SPE凈化。

 液相色譜條件

• 液相色譜系統(tǒng)：ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)
  

• 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱, 1.7 μm，2.1 mm x 50 mm

• 進(jìn)樣體積：5 μL

結(jié)果與討論

 高通量，一針進(jìn)樣，同時檢測

該方案5 min內(nèi)即可完成6種脂溶性維生素的同時測定，可同時檢測血清中維生素A(VA)、25-羥基維生素D2(25OHVD2)、25-羥基維生素D3(25OHVD3)、維生素E(VE)、維生素K1(VK1)、四烯甲萘醌K2(VK2-MK-4)，真正實現(xiàn)“一針進(jìn)樣，同時檢測”。

圖2. 6種脂溶性維生素的標(biāo)準(zhǔn)品和血清色譜圖。

 靈敏度高，線性范圍寬，滿足臨床檢測需求

正常人體血清中維生素A含量113 - 977 ng/mL；維生素E含量3.8 - 17 μg/mL；維生素D含量20 - 50 ng/mL；維生素K1含量為0.10 - 2.20 ng/mL。由于6種脂溶性維生素在血清中含量差異較大，VK1、MK4和25OH-VD2含量低，同時測定高低濃度物質(zhì)是串聯(lián)質(zhì)譜測定的難點(diǎn)，常存在低濃度、靈敏度差及高濃度過飽和現(xiàn)象。而Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD優(yōu)異的靈敏度及超寬線性范圍，可實現(xiàn)同時準(zhǔn)確定量這幾種維生素。

自動化前處理，滿足高通量檢測需求

Andrew+機(jī)器人可在無人值守狀態(tài)下自動完成移液、震蕩、混勻和96孔板SPE前處理過程。不僅大幅節(jié)省了樣品處理的時間，提高了通量，還可以簡化樣品制備過程、減少實驗失誤，從而確保分析結(jié)果的穩(wěn)定重現(xiàn)。手動前處理96個樣本的時間大概是2 - 3 h。如果用Andrew+做自動化前處理，只需要提前把溶劑和樣本放到設(shè)置好的Domino blocks里中就可以完成自動化前處理和SPE流程。過程僅需不到1 h就可以完成。

結(jié)論

本方案使用Waters UPLC I-Class超高效液相色譜系統(tǒng)搭載UPLC色譜柱進(jìn)行分離，再用Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀對血清樣品中6種脂溶性維生素定量檢測。96個樣本的前處理不到1 h，每個樣本的液相分析時間僅5 min，每天可以檢測至少200例樣本。6個脂溶性維生素的加標(biāo)回收率85% - 115%之間，精密度RSD<8%，保證該方法檢測樣品的準(zhǔn)確性和可靠性，可適用于臨床高通量、自動化的樣品檢測。

       2019年底，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)肆虐，它的出現(xiàn)及其在世界范圍內(nèi)的廣泛傳播引發(fā)科技工作者對ZL新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)藥物的廣泛關(guān)注。鑒于COVID-19的高傳播性，并且目前尚沒有疫苗對其進(jìn)行有效預(yù)防，研發(fā)ZL該肺炎的藥物就變得尤為重要。Z近，瑞德西韋、磷酸氯喹和法匹拉韋等多種藥物已被證明在抗擊COVID-19方面具有潛在活性。

       迪馬科技一直致力于為藥物研發(fā)和檢測提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，針對抗COVID-19藥物檢測，迪馬科技技術(shù)人員開發(fā)了一種快速LC-MS/MS方法。應(yīng)用該方法可以同時快速測定6種潛在ZL藥物。本方法選用Endeavorsil^? 1.8 μm C18色譜柱，在4.5分鐘內(nèi)即可完成6種藥物的同時檢測。方法具有簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)。可以預(yù)期，該方法的應(yīng)用必將使得這些潛在藥物的檢測變得更加方便、GX，并有助于抗COVID-19藥物的進(jìn)一步研究和檢測。

       六種化合物的分子結(jié)構(gòu)如下：

瑞德西韋

磷酸氯喹

法匹拉韋

洛匹那韋

沙奎那韋

利托那韋

1、適用范圍

       本方法適用于瑞德西韋、磷酸氯喹、法匹拉韋、洛匹那韋、沙奎那韋、利托那韋6種潛在ZLCOVID-19藥物的檢測。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

       單標(biāo)儲備液：磷酸氯喹溶于甲醇:水(1:1 v/v)混合溶液中，瑞德西韋、法匹拉韋、洛匹那韋、沙奎那韋、利托那韋溶于甲醇溶液中。

       單標(biāo)中間液：將各單標(biāo)儲備液配置成4 mg/mL的中間液，稀釋液為甲醇。

       混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：各單標(biāo)濃度見表一，稀釋液為流動相。

3、色譜條件

       色譜柱：Endeavorsil^? 1.8 μm C18, 100 × 2.1 mm(Cat＃: 87003)

       液相系統(tǒng)：Agilent 1290 Infinity UPLC、AB SCIEX 4000 + MS

       流動相：A:0.1％甲酸水溶液   B:0.1％甲酸乙腈溶液 

       流速：0.2 mL/min  

       進(jìn)樣量：1 μL

       溫度：30 ℃

       掃描方式：ESI +

       梯度設(shè)置：

4、檢測結(jié)果

圖1六種化合物檢測TIC圖

圖2 六種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

表1六種化合物檢測參數(shù)和結(jié)果

       利用Endeavorsil^? 1.8 μm C18色譜柱，6種潛在ZLCOVID-19藥物能夠在4.5分鐘內(nèi)實現(xiàn)完全分離 (圖1)。表1列出了洗脫順序、樣品濃度、保留時間、離子對信息。

5、結(jié)論

　　本文提供了一種有效的同時檢測6種潛在ZLCOVID-19藥物的方法，其優(yōu)點(diǎn)包括：流動相簡單、分析速度快、靈敏度高和色譜峰形良好。據(jù)檢索，本方法為國內(nèi)外shou次利用LC-MS/MS同時分離、測試和確證6種潛在ZLCOVID-19藥物的檢測方法。迪馬科技希望本方法能夠為COVID-19ZL藥物在研發(fā)、生產(chǎn)以及臨床試驗等階段的常規(guī)測試中提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

６、相關(guān)產(chǎn)品信息

       LC-MS/MS法同時測定6種潛在ZL新型冠狀病毒肺炎藥物相關(guān)產(chǎn)品信息：

現(xiàn)行使用的2020年版藥典中，對于黃曲霉毒素的檢測有明確要求，現(xiàn)檢測品種由2015年藥典要求的19種中藥材增加到25種中藥材原料，及用這些原料制成的飲片、丸劑等成品藥，現(xiàn)有2020年版藥典中對于黃曲霉的檢測方法有三種，第一種是高效液相色譜法+光化學(xué)衍生法；第二種是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；第三種是酶聯(lián)免疫法。現(xiàn)在大部分藥檢所機(jī)構(gòu)及中藥企業(yè)實驗室基本采用第一種方法居多，不管是從檢測復(fù)雜程度、設(shè)備成本、耗材成本多方面考慮，第一法都有一定的優(yōu)勢。我們公司可以提供第一法的解決方案，并給國內(nèi)100+中藥企業(yè)提供過解決方案，如需要解決方案的可與我們溝通聯(lián)系。

現(xiàn)行藥典方法都是化驗室用來定量檢測的，從樣品前處理到得到結(jié)果，最快也需要3小時以上，而這是樣品已經(jīng)入庫，對于黃曲霉風(fēng)險比較高的樣品，例如酸棗仁、柏子仁、遠(yuǎn)志等中藥材，如果已經(jīng)入庫后，且黃曲霉超標(biāo)，該樣品將無法進(jìn)入到生產(chǎn)環(huán)節(jié)，這樣對于企業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失將是非常大的，那就急需要一種能現(xiàn)場快速檢測黃曲霉的設(shè)備，并且結(jié)果有保證的檢測方法。

中檢維康生物公司提供一套現(xiàn)場快速檢測中藥材黃曲霉的方案，基于膠體金免疫層析快速檢測技術(shù)（GICA）通過圖像分析技術(shù)定量快速檢測中藥材中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素總量、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮，以及赭曲霉毒素A等真菌毒素的含量。