維生素是維持人體生命活動所必需的一類營養(yǎng)物質(zhì)，大多數(shù)由食物供給，屬于人體內(nèi)的一類調(diào)節(jié)物質(zhì)。維生素分為水溶維生素和脂溶維生素，脂溶性維生素是不溶于水而溶于脂類的一類維生素，在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，包含維生素A、維生素D、維生素E和維生素K。

VD在肝臟可轉(zhuǎn)化為25羥基維生素D(25OH-VD)，其濃度水平與體內(nèi)的VD直接相關(guān)，因此體內(nèi)25OH-VD2、25OH-VD3可作為檢測VD水平的生物標(biāo)志物。VK是激活凝血因子以及蛋白質(zhì)C和S的必須輔助因子，目前已知主要有K1、K2、K3、K4幾種形式，四烯甲萘醌VK2(MK4)既是VK2的家族成員，也是肝外組織中K1的代謝物。當(dāng)這些脂溶性維生素缺乏或過量時均會對人體造成傷害。具體見下表：

一次性評估體內(nèi)多種維生素水平，才能全面“查漏補(bǔ)缺”。準(zhǔn)確測定人體中性維生素的含量，可以幫助臨床醫(yī)生準(zhǔn)確評估人體維生素營養(yǎng)狀態(tài)、吸收障礙或毒性水平。

解決方案

沃特世團(tuán)隊(duì)依托質(zhì)譜平臺ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD和 TQ-XS IVD開發(fā)了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)在維生素檢測中的應(yīng)用，在5 min內(nèi)即可完成6種脂溶性維生素的同時分析。前處理采用Andrew Alliance機(jī)器人搭配Oasis μElution PRiME HLB的固相萃取板，實(shí)現(xiàn)樣本前處理自動化，并解決LC-MS/MS檢測維生素的各種挑戰(zhàn)和難點(diǎn)。該方法檢出限低、分離效果好、穩(wěn)定性佳，可滿足臨床高通量自動化檢測需求。

圖1. Andrew+移液機(jī)器人用于6種脂溶性維生素前處理操作時的工作臺布局，以及ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-XS IVD檢測平臺。

實(shí)驗(yàn)部分

 前處理

• 樣本預(yù)處理：取100 μL 血清或者BSA稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，加入內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻，隨后加入乙腈沉淀蛋白，離心取上清液，做SPE凈化。

 液相色譜條件

• 液相色譜系統(tǒng)：ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)
  

• 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱, 1.7 μm，2.1 mm x 50 mm

• 進(jìn)樣體積：5 μL

結(jié)果與討論

 高通量，一針進(jìn)樣，同時檢測

該方案5 min內(nèi)即可完成6種脂溶性維生素的同時測定，可同時檢測血清中維生素A(VA)、25-羥基維生素D2(25OHVD2)、25-羥基維生素D3(25OHVD3)、維生素E(VE)、維生素K1(VK1)、四烯甲萘醌K2(VK2-MK-4)，真正實(shí)現(xiàn)“一針進(jìn)樣，同時檢測”。

圖2. 6種脂溶性維生素的標(biāo)準(zhǔn)品和血清色譜圖。

 靈敏度高，線性范圍寬，滿足臨床檢測需求

正常人體血清中維生素A含量113 - 977 ng/mL；維生素E含量3.8 - 17 μg/mL；維生素D含量20 - 50 ng/mL；維生素K1含量為0.10 - 2.20 ng/mL。由于6種脂溶性維生素在血清中含量差異較大，VK1、MK4和25OH-VD2含量低，同時測定高低濃度物質(zhì)是串聯(lián)質(zhì)譜測定的難點(diǎn)，常存在低濃度、靈敏度差及高濃度過飽和現(xiàn)象。而Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD優(yōu)異的靈敏度及超寬線性范圍，可實(shí)現(xiàn)同時準(zhǔn)確定量這幾種維生素。

自動化前處理，滿足高通量檢測需求

Andrew+機(jī)器人可在無人值守狀態(tài)下自動完成移液、震蕩、混勻和96孔板SPE前處理過程。不僅大幅節(jié)省了樣品處理的時間，提高了通量，還可以簡化樣品制備過程、減少實(shí)驗(yàn)失誤，從而確保分析結(jié)果的穩(wěn)定重現(xiàn)。手動前處理96個樣本的時間大概是2 - 3 h。如果用Andrew+做自動化前處理，只需要提前把溶劑和樣本放到設(shè)置好的Domino blocks里中就可以完成自動化前處理和SPE流程。過程僅需不到1 h就可以完成。

結(jié)論

本方案使用Waters UPLC I-Class超高效液相色譜系統(tǒng)搭載UPLC色譜柱進(jìn)行分離，再用Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀對血清樣品中6種脂溶性維生素定量檢測。96個樣本的前處理不到1 h，每個樣本的液相分析時間僅5 min，每天可以檢測至少200例樣本。6個脂溶性維生素的加標(biāo)回收率85% - 115%之間，精密度RSD<8%，保證該方法檢測樣品的準(zhǔn)確性和可靠性，可適用于臨床高通量、自動化的樣品檢測。