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  亂世浮生一聲嘆 2017-09-02 18:42:06

  　　硝酸還原酶是植物氮素代謝作用中的關鍵性酶，它與作物吸收和利用氮肥有關。NR作用于NO3-使其還原為NO2ˉ： NO3ˉ+NAD(P)H+H+→NO2ˉ+NAD++H2O 產生的NO2ˉ 可以從組織內滲透到外界溶液中，并積累在溶液中，測定反應溶液中NO2-含量的增加，即可表現NR活性的大小。 NO2ˉ含量的測定采用對氨基苯磺酸（sulfanil-amide）比色法。在酸性溶液中對氨基苯磺酸與NO2ˉ 形成重氮化合物，該重氮化合物在進一步與α-萘胺偶聯形成紫紅色的偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在pH 7.5時540 nm處有Z大吸收峰，可用分光光度法測定其光吸收值，從而間接測得溶液中的NO2ˉ的量。這種方法非常靈敏，能測定每mL含0.5 μg的NaNO2。 硝酸還原酶活性可由產生的亞硝態氮的量表示。一般以 μg NO2ˉ /( gFW· h )為單位。 一、儀器、藥品與材料 　　（一）實驗材料 新鮮的植物葉片（如豌豆、王米、小麥、大豆等）。 　　（二）儀器與用品 50mL三角瓶、打孔器（直徑 0.5 cm）、真空泵、溫箱、分光光度計、移液管 （5mL 3 個、 1 mL 2 個、 2 mL 2 個）、天平 1 臺。 　　（三）試劑 1．1%對氨基苯磺酸：稱取1.0 g對氨基苯磺酸溶于 100 mL 3 mol/L HCl 中（25 mL 濃鹽酸加水定容至 100 mL ，即為 3 mol/L HCl ）。 2．α-萘胺試劑：稱取0.2 g α-萘胺，用含1 mL濃鹽酸的蒸餾水溶解，再用蒸餾水稀釋至100 mL。 3．NaNO2 標準液：稱取 0.1 g NaNO2，用蒸餾水溶解后定容至100 mL。吸取其中5 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL。此溶液每毫升含有5 μg NaNO2，用時再根據不同需要稀釋。 4．0.2 mol/L KNO3：稱取 KNO3 2.002 g，用蒸餾水溶解，移入100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。 5．0.1mol/L磷酸緩沖液，pH 7.5：見附錄7。 二、實驗步驟 1．將新鮮取回的葉片洗凈，用吸水紙吸干，再用鉆孔器鉆成直徑約1 cm的圓片，Z后稱取等重的葉圓片兩份，每份約0.3~0.4g（或每份取50個圓片），分別置于含有下列溶液的50 mL三角燒瓶中：（1） 0.1mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.5）5 mL +蒸餾水5 mL（對照組）；（2）0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.5）5 mL +0.2 mol/L KNO3 5 mL（實驗組）。將三角燒瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣，放氣后，圓片即沉于溶液中。如果沒有真空泵，也可以用20 mL注射器代替：將反應液及葉子圓片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使其真空，如此抽氣放氣反復進行多次，即可使圓片中的空氣抽去而沉于溶液中。將三角燒瓶置于30℃溫箱中，暗中保溫30min后，分別吸取反應溶液1mL，用于測定NO2ˉ含量。 2．NO2ˉ含量測定 將步驟一中吸取的1 mL反應溶液置于一試管中，加入對氨基苯磺酸試劑2 mL及α-萘胺試劑2 mL，混合搖勻，靜置30min，立即用分光光度計測定520nm處的吸光度（OD）值。 3．繪制標準曲線 分別吸取不同濃度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5 μg/mL）各1 mL于試管中，加入對氨基苯磺酸試劑2 mL及α-萘胺試劑2 mL，混合搖勻，靜置30min，立即520nm處的OD值。然后，以OD值為縱坐標，NaNO2濃度為橫坐標繪制OD值-濃度標準曲線，或者根據濃度與OD值關系直接計算回歸方程。 4．從標準曲線上查得實驗組與對照組反應液中的NaNO2含量，并計算硝酸還原酶活性： 酶活性（μg NaNO2/ g FW· h）=(C2-C1)×V/t×W 式中： C1——1 號三角瓶里 NaNO 2濃度（μg/mL） 。 C2——2 號三角瓶里NaNO 2濃度（μg/mL）。 V ——反應液總體積（mL） 。 t ——反應時間（h）。 W ——植物鮮重（g）。 　　注意事項： 　　1．硝酸還原酶容易失活，離體法測定時，操作應迅速，并且在4℃下進行。 　　2．硝酸鹽還原過程應在黑暗中進行，以防亞硝酸鹽還原為氨。 　　3．從顯色到比色時間要一致，顯色時間過長或過短對顏色都有影響。

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