在疫情仍未停歇的當下，做好個人防護對每個人來說既是簡單的，又是必要的。而群體防護的順利實施，則要歸功于抵抗新冠的各類疫苗了。這其中，就有免疫效果不錯的mRNA疫苗。mRNA疫苗具有廣泛的應用領域和顯著的治療優勢，因而成為諸多藥企競相追逐的熱點。本期，小編就帶大家了解一下mRNA疫苗開發的工藝流程。

01 DNA原液供應

質粒 DNA (pDNA) 是mRNA疫苗生產不可或缺的原材料，可用作 mRNA 的模板。在制備時，第一步是要提取病毒刺突蛋白的DNA序列，然后構建帶有該序列的DNA質粒，接著經過擴增、純化、質檢等諸多過程形成我們最終所需的DNA原液。

在mRNA疫苗開發應用方面，質粒生產也面臨著諸多的壓力，尤其是 GMP的壓力。

02 mRNA原液制備 體外轉錄（IVT）是mRNA原液制備的主要手段。pDNA 可作為IVT的模板，合成所需的 mRNA 分子。 IVT的工藝比較復雜，除使用pDNA外，還需要添加合成mRNA的必要成分，如核苷酸和mRNA聚合酶。為提高mRNA穩定性，降低其免疫原性，還需在 mRNA的5'末端添加加帽試劑。除此之外，合理設計5'或3'非翻譯區(UTR)也可以調整mRNA的穩定性及蛋白質的翻譯效率。 mRNA的純度影響著翻譯后蛋白的效力，因此，mRNA原液制備后的純化過程也是必不可少的，可采用TFF（切向流過濾）或SEC（尺寸排阻色譜）等方法來去除少量殘留雜質。

03 mRNA包封 為防止疫苗有效成分mRNA進入細胞前被降解，可采用脂質納米顆粒(LNP)對其進行包裹。具體過程為：將各種脂質成分按一定的比例進行混合，溶解在乙醇或其他有機溶劑中；將mRNA溶解于水中，并用酸性緩沖液稀釋至合適濃度。配置好的兩相溶液在微流控設備上進行均勻混合，快速制備包裹mRNA的核酸脂質納米顆粒。與微流控設備匹配的核心耗材為微流控芯片，圖1即為芯片內部通道示意圖。 

圖1.微流控芯片通道示意圖

04 后處理 mRNA包封后需要進一步的純化。可通過超濾去除有機相以及未包封的游離成分。超濾過程中可以進行溶劑緩沖體系的置換，以及PH值的調節，最終復合物的濃度根據需求進行靈活控制。 

圖2.超濾管

 至于細菌、微生物的清除，一般采用0.22μm的除菌級過濾器即可。 純化后的mRNA-LNP溶液還可以添加必要的輔料成分，以提升產品長期保存的穩定性。

05 儲存運輸 mRNA疫苗布局開發過快也帶來了些不可避免的問題，即需要低溫來保持疫苗穩定，這大大的提升了對儲存和運輸的要求。在儲存運輸過程中需進行持續的溫度監測，以確保產品始終處于規定的溫度范圍，否則很難保證最終患者給藥時產品的安全性和有效性。 總結：mRNA疫苗有著廣闊的應用前景，其開發過程也必然充滿挑戰。了解開發的各個工藝流程，方能鎖定難點，各個擊破，向疫苗的成功開發更進一步。  

納米藥物制備系統

應用范圍：

● 核酸藥物發展的前沿方向

● mRNA疫苗的開發與挑戰

● 核酸脂質納米粒科普——淺談儀器參數對結果的影響

● 核酸脂質納米?？破铡瑸V管規格

● 核酸脂質納米?？破铡筇幚?/p>

 
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早在幾十年前，研究者們首次發現，外源的mRNA經肌肉注射至小鼠體內后有相應的蛋白表達，這也成為了mRNA疫苗的雛形。人們一直以來都希望能夠生產出一種靈活、易于生產、安全有效的疫苗。而mRNA疫苗就是一種可以滿足這些需求的，具有良好的發展前景的新疫苗。而時至今日，在新冠疫情的背景下，mRNA疫苗也不負重望的成為了一顆耀眼的明星，輝瑞、Moderna等公司的mRNA新冠疫苗相繼展現出了良好的預防效果，使得mRNA疫苗愈發受到人們的關注。
而合適的mRNA遞送載體一直是制約mRNA疫苗發展的一大瓶頸，一個合適的mRNA遞送載體可實現對mRNA的GX包載，并在體內實現良好的表達效果。目前常用的幾種mRNA遞送載體主要包括：聚合物材料、多肽、脂質納米粒。下面我們就簡要介紹一下這幾種mRNA遞送載體。


（一） 聚合物材料

早期人們采用聚合物材料來進行核酸的遞送，如聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）、聚氨基酯（PBAE）、殼聚糖等。大多數用于mRNA遞送的聚合物材料都需要進行脂肪酸鏈的修飾，以改善其安全性，但這些材料的應用目前都只停留在臨床前研發階段。有研究就采用PEI用于將DNA通過吸入的方式輸送到肺部。然而PEI不易分解，因此對于可能需要的重復給藥，聚合物可能累積并引起副作用?！?】也有研究采用分支型的聚胺基聚合物進行mRNA的包載，構建一套樹狀聚合物RNA納米粒，并成功在體內表達出了對抗翟卡病毒、埃博拉病毒的相關抗體?！?】

圖1. 麻省理工研究團隊采用

聚合物材料制備的mRNA納米?！?】

（二） 多肽

也有少量的研究中采用了細胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides，CPPs）用于mRNA的遞送，如采用包含有兩親性序列精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（Arg-Ala-Leu-Ala）的細胞穿膜肽來結合mRNA構建成一種CPP-mRNA復合納米粒，其可以發揮CPP跨越細胞膜的能力，將mRNA很好的遞送到細胞內，并引發了良好的T細胞應答?！?】

（三）脂質納米粒

人們采用離子化的脂質進行siRNA的遞送，并在2018年由Alnylam制藥公司推出了上市的RNAi藥物Onpattro，其就是通過離子化的脂質制備的脂質納米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）進行siRNA的包載和遞送。受其啟發，目前研究者們也紛紛選擇LNPs作為mRNA遞送的載體。LNPs主要通過陽離子的磷脂材料與其他輔助磷脂完成顆粒的構建，通過RNA所帶的負電與陽離子磷脂的正電相互吸附，可實現較高的包載效果，并且在體內由低密度脂蛋白介導的胞吞機制可使納米粒子成功被細胞攝取，實現良好的細胞攝取效果。在胞內經由內含體途徑將mRNA成功釋放，轉運到細胞質中進行表達，產生相應的蛋白表達。同時良好的體內安全性也使他更具競爭力，在多種傳染性疾病的預防及ZL方面展現出了較好的效果。其中已有大量的研究已經進入了臨床研究階段，如在兩項臨床一期的流感病毒疫苗研究中，通過LNPs包載核苷酸修飾的mRNA，所產生的機體免疫應答與傳統的滅活流感病毒疫苗相似，并且安全性也基本一致?！?】在新冠疫情的背景下，輝瑞與Biotech的mRNA疫苗更是緊急上市，同樣采用LNPs作為mRNA的遞送載體，并展現出了超過90%的有效率。

圖3. 常見的LNPs構造

目前在多種mRNA遞送載體中，LNPs還是更優的選擇，但是如何開發出新的配方材料，打破相關ZL壁壘，同樣是相關研究者爭相努力的方向。同時伴隨著RNA序列編輯、RNA的大批量快速生產等相關研究的進一步發展，未來mRNA疫苗相關技術會愈發成熟，會引領接下來一段時間的藥物研發相關的風潮。
 

參考文獻：

1. James Cliff Kaczmarek, Kevin J Kauffman et al.: Optimization of a Degradable Polymer-Lipid Nanoparticle for Potent Systemic Delivery of mRNA to the Lung Endothelium and Immune Cells. Nano Lett 2018, DOI: 10.1021/acs.nanolett.8b02917.

2. Chahal JS, Khan OF, Cooper CL et al.:Dendrimer-RNA nanoparticles generate protective immunity against lethal Ebola, H1N1 influenza, and Toxoplasma gondii challenges with a single dose. Proc Natl Acad Sci USA 2016,113:E4133-4142.

3. Udhayakumar VK, De Beuckelaer A et al.: Arginine-rich peptide-based mRNA nanocomplexes efficiently instigate cytotoxic T cell immunity dependent on the amphipathic organization of the peptide. Adv Healthc Mater 2017, 6.

4. Feldman RA, Fuhr R et al.: mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses of pandemic potential are immunogenic and well tolerated in healthy adults in phase 1 randomized clinical trials. Vaccine 2019, 37:3326-3334.

納米藥物制備系統

應用范圍：

顯微計數法不溶性微粒儀應用于mRNA疫苗注射劑

隨著2019年疫情在大范圍內的大流行，新冠疫苗也再一次被人們重視起來，今天梓夢科技的小編就想和大家聊聊關于mRNA疫苗檢測時需要用到顯微計數法不溶性微粒儀檢測的問題。

在說具體的顯微計數法不溶性微粒儀檢測的流程之前，梓夢科技的小編先介紹一下什么是mRNA疫苗。眾所周知，mRNA疫苗是繼滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗和病毒載體疫苗后的第三代疫苗,具有針對病原體變異反應速度快、生產工藝簡單、易規模化擴大等特點，它的基本原理是通過特定的遞送系統將表達抗原靶標的mRNA導入體內，在體內表達出蛋白并刺激機體產生特異性免疫學反應，從而使機體獲得免疫保護。我們都知道當mRNA疫苗研發成功之后不能被立即使用，在使用之前是需要進行檢測的，這時候對于mRNA疫苗的檢測方法就需要顯微計數法以及需要使用顯微計數法不溶性微粒儀來檢測。下面就讓小編給您介紹一下進行顯微計數法不溶性微粒儀檢測時需要用到的配件展示。

顯微計數法不溶性微粒儀配件展示：

（1）樣品過濾裝置，烘干裝置，檢測分析軟件，電腦等。

（2）需要配置奧林巴斯反射顯微鏡、徠卡金相顯微鏡、尼康金相顯微鏡或者國產反射系統顯微鏡均可。

顯微計數法不溶性微粒儀儀器展示：

mRNA疫苗樣品展示：

以下是具體的顯微計數法不溶性微粒儀檢測步驟：

（1）首先對空白濾膜進行檢查，將空白濾膜放置于測試平臺，對整個濾膜進行掃描后做分析，確保濾膜本身是干凈的。

（2）把濾膜潤濕之后放置在過濾裝置上，固定后倒入樣品，進行抽濾，然后用50ml檢查用水沖洗。

（3）將濾膜取出，放入到金屬浴中進行烘干，烘干溫度45℃，一般大約10分鐘左右即可。

（4）用專用平頭鑷子將烘干的濾膜放入顯微計數法不溶性微粒儀下，進行整圖掃描。

（5）分析實驗數據，導出標準報告；

通過以上梓夢科技的小編介紹的顯微計數法的檢測步驟，很多感興趣的朋友肯定會疑惑，擁有顯微計數法不溶性微粒儀和會使用顯微計數法檢測的的公司那么多，為什么還要梓夢科技的顯微計數法不溶性微粒儀來檢測呢？原因是梓夢科技的顯微計數法不溶性微粒儀MIP-01Z具有以下的優勢：

①　直接按照藥典要求出具報告；

②　全自動進行濾膜全掃描，并進行顆粒圖片分析；

③　軟件符合法規要求；

④　按照顆粒性質進行歸類分析統計；

⑤　光阻法檢測不通過時，作為不溶性微粒檢測的一個判定。

通過梓夢科技小編的介紹，相信對顯微計數法如何檢測mRNA疫苗的流程的朋友都已經清楚了，如果對梓夢科技的顯微計數法不溶性微粒儀感興趣的朋友歡迎咨詢上海梓夢科技。