見微知著 | CytoFLEX nano納米流式分析儀檢測并表征乏血小板血漿樣本中的EVs
細胞外囊泡（EVs）是由所有細胞釋放的異質性膜顆粒家族，為多種生理過程及疾病研究提供關鍵信息。深入研究EVs需對其精確表征，然而其異質性、尺寸不均一性、折射指數及復雜性使其分析極具挑戰。
一起來看下具備
優秀靈敏度和分辨率的4激光6色的CytoFLEX nano納米流式分析儀
是如何應對的：
CytoFLEX nano納米流式分析儀通過405 nm激光激發側向散射光可檢測小至40納米的顆粒，六色熒光檢測通道提供更優的靈敏度與分辨率。
以下研究采用5色組合方案，對乏血小板血漿（PPP）樣本中的EVs亞群進行免疫表型表征。
方法
乏血小板血漿（PPP）細胞外囊泡制備流程如下：
取3 mL新鮮人全血，200 xg離心5分鐘；
吸取上層血漿1 mL，經200 nm注射器過濾器初濾后，采用iZON qEV 70 nm尺寸排阻色譜柱（SEC）純化PPP；
篩選特定組分分別進行單色及多色染色用于免疫分型；
所選PPP組分使用以下抗體標記：CD81 PB、CD9 FITC、CD63 APC、CD61 PC7、CD235a PE；
樣本經CytoFLEX nano納米流式分析儀檢測，數據通過CytExpert for nano軟件分析。
實驗結果
圖1：對聚集體的檢測
圖2：樣本稀釋優化方案-非群集條件與穩定MdFI
（經篩選確定樣本稀釋度，確保滿足：1. 非群集狀態（<6000 eps）；2. 事件收集率100%；3. 稀釋梯度內MdFI穩定性）
圖3：目標組分篩選結果
（選定粒徑分布最寬的組分5）
圖4：五色抗體組合的單色質控策略
（執行單色對照實驗以計算熒光補償）
圖5：五色抗體組合熒光補償校正及亞群分析策略
（CytExpert nano軟件精準補償；通過設門鑒定：1. 紅細胞陰性EVs；2. 血小板源性EVs；3. 非血小板源性EVs）
設門策略分步解析
單顆粒群圈定；
排除CD235+事件（疑似聚集體）；
在CD235-群體中鑒定CD61+（血小板源性EVs）和CD61-；
進一步區分：CD9+亞群和CD9-亞群；
在以上亞群中鑒定CD81+和CD63+。
圖6：特征性EVs亞群鑒定
（設門策略示例圖示）
結論
基于iZON qEV 70 nm色譜柱收集組分的粒徑分布與熒光染色特征，本研究成功定位細胞外囊泡（EVs）富集組分。CytoFLEX nano納米流式分析儀可檢測單個PPP-EV顆粒上多種熒光信號（包括PB、FITC、PE、PC7及APC）。
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