精氨酸在抗體純化中的應用案例分享

來源：Cytiva（思拓凡）分類：應用方案

2024-10-24 09:28:44 111閱讀次數

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精氨酸 (Arginine, Arg) 分子量為174.20 g/mol，是一種天然的堿性氨基酸，其安全性已得到FDA認可，能用于生物制藥工藝中，常作為蛋白質純化中的溶劑添加劑和蛋白質處方中的保護劑。

其分子結構主要包括3個部分：極性端（由氨基和羧基組成）、脂肪族片段（3個亞甲基）和胍基末端（圖1）。胍基的pKa為13.8，使得精氨酸在酸性、中性甚至大多數堿性環境中都帶正電荷。精氨酸大多數情況下以特定的鹽形式（最常見的是鹽酸鹽Arg-HCl）使用^[1]。

圖1：L-精氨酸的基本化學結構圖

精氨酸及其鹽在增強蛋白質折疊和溶解、抑制蛋白質相互作用和聚集、降低高濃度蛋白質制劑的粘度等方面具有顯著的效果^[2]。其作用機理目前尚不明確，主要被認為有以下幾種作用方式^{[1, 3, 4]}：

靜電相互作用：精氨酸帶正電，可中和蛋白質表面負電荷，減弱靜電吸附，降低蛋白質在層析填料上的保留時間，促進洗脫。其正電性也可以有效增強帶正電荷的蛋白分子之間的靜電排斥作用，進而減緩蛋白的聚集。

氫鍵作用：精氨酸側鏈的胍基上存在3個氮原子，由于雙鍵和氮原子的孤對電子之間的共軛，正電荷被離域，促進多個氫鍵的形成。精氨酸可以通過氫鍵與蛋白質側鏈相互作用，從而影響蛋白質之間的氫鍵。另外，精氨酸也可以通過阻斷蛋白質間的鹽橋形成來抑制聚集。

疏水相互作用：精氨酸能與暴露在蛋白外層的疏水性氨基酸側鏈適度結合，降低蛋白分子間疏水性區域的碰撞機率，從而減少蛋白質分子間因疏水相互作用而引起的聚集和沉淀。

陽離子-π相互作用：精氨酸的胍基會與芳香族氨基酸形成陽離子-π相互作用，以維持蛋白質及其中間體的穩定性。

抗體純化平臺通常包括一個親和捕獲步驟和1-2個精細純化步驟。抗體純化階段，通過在上樣、淋洗或洗脫緩沖液中添加精氨酸，有助于去除聚集體 (aggregate) 、宿主細胞蛋白 (HCP) 或者提高回收率及樣品的純度。本次智薈專線將為大家分享精氨酸在抗體親和、陽離子、疏水以及多模式層析中的幾個典型應用案例。

案例一

利用精氨酸促進抗體從親和柱上洗脫

抗體純化第一步通常使用Protein A親和層析進行捕獲和富集，通過降低pH（通常在pH 3-4之間）進行洗脫，然后低pH值孵育一段時間進行病毒滅活，再采用堿性緩沖液進行中和。低pH可能會引起抗體構象發生變化，導致聚集。為了防止抗體分子在酸性條件下的進一步聚集，需對洗脫條件進行優化。有研究表明，精氨酸可促進抗體-Protein A復合物的解離并抑制洗脫抗體的聚集^[5]。

如下案例中，采用Protein A親和柱純化hIgG4，考察不同洗脫液的洗脫效果，結果如圖2所示，相比于檸檬酸，精氨酸可以在更高的pH條件下，促進樣品洗脫從而提高回收率，而更溫和的洗脫條件也避免了樣品因為低pH而產生聚集。但是，其他氨基酸（賴氨酸、脯氨酸、甘氨酸和組氨酸）卻沒那么有效。文章中也利用鹽酸胍來洗脫抗體，雖然具有良好的回收率，但洗脫液中出現了更多的聚集體，這可能是因為胍的變性作用造成的^[6]。

圖2：Protein A純化hIgG4，不同洗脫液的收率結果

案例二

利用精氨酸在親和層析中去除HCP

細胞上清中表達的HCP雜質與抗體分子之間可能存在相互作用，這是造成Protein A洗脫樣品中HCP水平較高的主要原因。通過增加合適的中間淋洗步驟，可有效清除大部分HCP。

該文章中采用MabSelect親和填料，搭配PreDictor板快速篩選中間淋洗條件，考察了NaCl (Control) 、精氨酸、EDTA、異丙醇 (IPA) 、丙二醇、辛酸鈉、triton x-100、尿素等添加劑在pH 5.5-9.0條件下對HCP的去除效果以及抗體收率的影響。結果如圖3所示，表明pH 7-9之間，在合適的濃度范圍內，精氨酸和尿素的HCP去除能力最強，丙二醇和triton x-100次之，同時收率可達90%以上^[7]。這是因為精氨酸可以通過其側鏈上的胍基，破壞HCP雜質和抗體分子之間的靜電、疏水和氫鍵相互作用；而尿素直接與抗體分子形成氫鍵，同時改變溶劑環境，從而減輕導致HCP-抗體相互作用的疏水效應，但高濃度尿素會解開蛋白質的三級結構。

圖3：pH 5.5-9.0條件下，不同淋洗緩沖液淋洗HCP結果 (A) 和抗體收率結果 (B)

案例三

利用精氨酸改善陽離子交換層析 (CEX) 中的洗脫雙峰問題

由于許多抗體的pI相對較高，當選擇的緩沖體系低于其等電點1-2 pH時，抗體帶正電荷，會與CEX填料上的負電荷基團結合，隨后可通過改變pH或/和鹽濃度來進行洗脫，以捕獲抗體并去除包括聚集體和電荷異構體在內的雜質。但在洗脫階段有時會出現雙峰或多峰現象，這可能是因為形成了組氨酸質子化異構體、或者形成了可逆或不可逆的自聚集導致的。

有文獻報道^[8]，在Capto SP ImpRes的洗脫液中加入帶正電荷的氨基酸（50 mM精氨酸、組氨酸、賴氨酸），如圖4所示，可以使抗體在較低濃度的NaCl下被洗脫，并改善可逆的自聚集 (Reversible Self-Association, RSA) ，降低第二個峰。這表明在CEX的洗脫液中添加帶正電荷的氨基酸有助于削弱蛋白結合，并降低蛋白質的構象變化。

圖4：Capto SP ImpRes線性梯度洗脫中添加不同氨基酸的洗脫條件和色譜圖

也有文獻報道^[9]，使用CEX純化IgG1抗體，在上樣、洗雜、洗脫階段添加低濃度精氨酸可以有效降低聚集體的形成，改善雙峰問題，同時去除HCP。如圖5所示，添加100 mM精氨酸后，洗脫主峰前移，IgG1抗體被更早洗脫，而且第二個峰基本上消失。洗脫液的分析結果如表1所示，對照組的聚集體含量增加了3.2倍，HCP去除效果不明顯；添加100 mM精氨酸后，聚集體含量降低了1.9倍，HCP殘留量降低了7倍，收率能達到91.3%。該案例也說明精氨酸能減弱蛋白結合，改善蛋白聚集。

圖5：利用精氨酸優化CEX的洗脫條件和色譜圖

表1：洗脫液的分析結果

案例四

利用精氨酸提高疏水層析的樣品純度和收率

一般聚集體的疏水性比單體要強，對于自身疏水性比較強的抗體，Capto Octyl、Capto Butyl等疏水性比較弱的填料可以作為優先選擇，通過篩選一個合適的上樣條件，就可以使目標抗體分布在流穿組分中，聚集體結合在填料上，從而實現有效分離。當然，也可以選用Capto Phenyl ImpRes或Phenyl HP高分辨率疏水填料，通過結合洗脫的方式高效去除聚集體，可通過添加乙二醇或精氨酸的方式提高收率。

以Capto Phenyl ImpRes層析線性梯度洗脫為例，結果如圖6所示，與對照組相比（純度98.8%，收率37.8%），使用乙二醇作為洗脫添加劑，樣品的SEC純度為98.2%，收率提高到76.4%；使用精氨酸作為洗脫添加劑，樣品的SEC純度提高到99.6%，收率提高到70%^[10]。

圖6：Capto Phenyl ImpRes去除聚集體的洗脫條件和色圖譜

案例五

利用精氨酸改善多模式層析中洗脫峰的拖尾問題

Capto MMC ImpRes同時具備電荷作用與疏水作用，平均粒徑40 μm，小粒徑可以帶來高分辨率，能有效分離單體和聚集體。圖7單抗純化案例中，聚集體含量為14%，通過Capto MMC ImpRes純化，在pH 5.5的條件下使用500 mM NaCl線性梯度洗脫，得到了高純度的單體分子，有效去除了目標產物中的聚集體，不過由于填料本身具備的疏水作用，洗脫峰會有部分拖尾，導致洗脫體積變大，從而降低了樣品的濃度。此時改用300 mM精氨酸進行線性梯度洗脫，能在保障分辨率的前提下縮小洗脫體積^[11]。這是因為精氨酸可以與樣品競爭性結合帶負電的MMC配基，并產生空間位阻效應，減弱電荷相互作用和疏水相互作用。

圖7：Capto MMC ImpRes去除聚集體（A-NaCl線性梯度洗脫，B-精氨酸線性梯度洗脫）

在另一案例中，利用Capto MMC ImpRes可有效去除雙特異性抗體 (bispecific antibody, BsAb) 中的半抗 (half antibody) 、同源二聚體 (homodimer) 和聚集體等雜質。結果如圖8所示，在pH 5.5的上樣條件下，發現homodimer結合能力強于half antibody，但略弱于目標BsAb，通過優化淋洗條件，增加Wash 2和Wash 3兩步淋洗，可有效去除half antibody和homodimer，再進一步提高鹽濃度洗脫目標BsAb。由于聚集體結合更緊密，采用50 mM NaAc-HAc，500 mM Arg-HCl，pH 5.5的strip條件，可以高效去除聚集體，峰形尖銳，沒有拖尾現象。通過優化淋洗步驟和洗脫條件，經HPLC分析之后，目標產物SEC純度從73.3%提高到了99.0%^[12]。

圖8：Capto MMC ImpRes去除BsAb中副產物的層析條件和色譜圖

總結

精氨酸通過多種作用機制（包括靜電、氫鍵、疏水、陽離子-π等相互作用）影響蛋白質的重折疊、聚集、溶解和純化過程，從而在抗體工藝開發中發揮重要作用，助力獲得低聚集體、低HCP、高回收率及高純度的產品。

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參考文獻

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