圖1. 2020年諾貝爾化學獎得主^[1]

CRISPR是“成簇規律間隔短回文重復序列”(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的縮寫，CRISPR系統是原核生物（包括細菌和古生菌）的一種天然防御機制，用于抵御噬菌體病毒的感染。

CRISPR/Cas系統由兩個部分：CRISPR基因序列與Cas基因組成。

CRISPR基因序列

由前導序列(leader)、重復序列(repeat)和間隔序列(spacer)構成：

1）前導序列：一段富含AT堿基的數百個堿基對，坐落于CRISPR基因的上游，并發揮著啟動子的關鍵作用。

2）間隔序列：細菌所俘獲的外源DNA片段的記錄，它們像是CRISPR系統的“記憶庫”，當相同的外源遺傳物質再次嘗試入侵時，CRISPR/Cas系統會精準地識別并予以打擊。

3）重復序列：長度約20–50bp堿基，內含5–7bp的回文序列，其轉錄產物能夠形成發卡結構，從而穩定RNA的整體二級結構。這些重復序列與間隔序列相互交錯，數量從幾個到數百個不等。

cas基因

Cas基因，位于CRISPR基因附近或散布于整個基因組的其他位置，它們所編碼的蛋白質包括Cas1至Cas10等。這些蛋白質在CRISPR/Cas系統中扮演著關鍵角色，與CRISPR基因序列協同工作，共同構成了這一強大的防御機制，從而保護原核生物免受噬菌體病毒的侵害。

圖2. CRISPR位點結構圖^[2]

CRISPR/Cas系統，根據其Cas蛋白的組成差異以及效應復合物的特性，可以被分為兩大類：Class1和Class2。

Class1系統：

這個類別的系統特征在于它包含一個由多個Cas蛋白構成的效應模塊。該模塊承擔著識別目標基因組、失活入侵DNA以及處理前CRISPR RNA（也稱為pre-crRNA）的關鍵任務。

Class2系統：

與Class1不同，Class2系統的標志性特征是它包含一個單一的多結構域CrRNA結合蛋白，比如在Class2系統中的Cas9。這種蛋白質具備實現干擾所需的全部活性，并且在一些變體中，它還整合了參與前crRNA加工的活性。

圖3. CRISPR系統分類^[3]

CRISPR/Cas系統中的Cas基因可以歸納為四個不同但部分重疊的功能模塊：適應模塊、表達處理模塊、干擾或效應模塊、信號轉導或輔助模塊，這些模塊共同協作以實現其基因組編輯的能力。

1）適應模塊：負責將新的遺傳信息整合到CRISPR序列中。它包括編碼關鍵酶Cas1（負責間隔序列的插入）和適應復合體亞單位Cas2的基因。此外，它還可能包含Cas4核酸酶、II-A亞型中的Csn2蛋白以及許多III型系統中的逆轉錄酶。

2）表達處理模塊：負責前crRNA處理。在大多數Class1系統中，Cas6是直接負責這一過程的酶。而在II型系統中，這一任務由細菌RNase III（一種非Cas蛋白）完成。在許多V型系統和所有VI型系統中，大型效應Cas蛋白內含一個專門的催化中心來處理前crRNA。

3）干擾或效應模塊：涉及目標識別和核酸裂解。在Class1系統中，效應蛋白模塊由多種Cas蛋白組成，如Cas3、Cas5-Cas8、Cas10和Cas11等。而在Class2系統中，效應蛋白模塊簡化為單一的大蛋白，如Cas9、Cas12或Cas13。

4）信號轉導或輔助模塊：這是一個包含眾多CRISPR連鎖基因的廣泛集合，它們在CRISPR-Cas系統中的作用大多是初步預測的。

由于Class2系統的簡便性和易用性，研究者主要關注Class2系統中的Cas亞型，以尋找潛在的新基因組編輯和診斷工具。Class2 CRISPR-Cas系統主要包括三種類型：II型（cas9）、V型（cas12）和VI型（cas13）。

II型系統

Ⅱ型系統中的代表為CRISPR/Cas9蛋白系統，Cas1、Cas2、Cas4蛋白負責重復間隔區的建立，RNaseⅢx協助crRNA的形成，而剩余的工作由Cas9蛋白完成。Cas9發揮功能時需要tracrRNA與crRNA共同作用（tracrRNA促進crRNA加工成熟，通過堿基配對與crRNA結合形成tracrRNA/crRNA復合，用于結合Cas9蛋白；crRNA與基因組DNA互補配對，用于結合模板DNA），當向導RNA與Cas9蛋白形成復合物后，Cas9蛋白的兩個DNA切割結構域（HNH和RuvC）發揮切割活性，HNH結構域切割與crRNA互補的鏈，RuvC結構域切割另一條鏈，從而實現了對目標DNA的雙鏈切割，這種精準的切割能力使得CRISPR/Cas9系統成為了基因編輯領域中最強大、最高效的工具之一。

V型系統

V型系統的單一效應蛋白為Cas12，與II型系統存在顯著差異。II型系統依賴于兩個DNA切割結構域——HNH和RuvC，而V型系統則僅擁有一個與RuvC相似的切割活性結構域；在guideRNA上，Cas9系統需要tracrRNA與crRNA的協同作用，而Cas12a系統則僅憑單一的crRNA便能完成使命。

值得一提的是，Cas9蛋白在切割雙鏈DNA后，產生的DNA末端為平末端。相比之下，Cas12a系統則會產生粘性末端，這一特性為其在基因編輯和核酸檢測等領域的應用提供了更多可能性。

此外，像Cas12a、Cas12b這樣的系統還具有反式切割活性。在crRNA的引導下，Cas12a能夠特異性地識別和切割雙鏈DNA（dsDNA），并隨后釋放單鏈脫氧核糖核酸酶（ssDNase）活性。這種活性使得Cas12a能夠無差別地裂解附近的單鏈DNA（ssDNA）。因此，Cas12a系統可以與LAMP等技術相結合，為核酸檢測等領域提供強大的工具。

圖4. 主要的CRISPR/Cas基因編輯工具^[4]

VI型系統

VI型系統的單一的效應蛋白為Cas13，具有靶向切割目標RNA的能力。Cas13含有兩個高等真核生物和原核生物核苷酸(HEPN)結合域結構，其上的RxxxxH保守基序是Cas13核酸酶催化活性位點。Cas13僅憑單個crRNA的引導，便能催化自身的前體pre-crRNA轉化為成熟的crRNA，當crRNA-Cas13a復合物形成時，crRNA便會引導復合物與靶標RNA進行堿基互補配對。通過這種機制，Cas13能夠特異性地對靶標RNA進行順式剪切，從而實現RNA敲除的目的。此外，Cas13還能以非特異性的方式對附近的RNA進行反式剪切，這一特性使其在基因編輯和RNA調控領域具有廣闊的應用前景。

CRISPR/Cas系統的具體作用機可分為以下三個階段：

當被外源噬菌體或質粒侵入時，含有CRISPR的細菌和古菌獲得插入間隔區的外源DNA片段；

當與間隔區同源的外來核酸再次進入細菌時，CRISPR陣列會被激活并轉錄產生前體crRNA（pre-crRNA）。同時，與pre-crRNA序列互補的tracrRNA也會被轉錄出來，tracrRNA在轉錄后會首先與Cas9蛋白結合，隨后與pre-crRNA通過互補堿基配對形成雙鏈RNA。這個雙鏈RNA與Cas9蛋白結合，形成一個功能強大的復合物。

在RNase III的作用下，pre-crRNA經歷初級和二次加工，多余的重復序列和間隔序列被去除，從而生成成熟的crRNA。這個成熟的crRNA具備了靶向特定DNA鏈的能力。

若細菌再次遭受同源DNA的感染，它會啟動CRISPR區域的轉錄，經過一系列的加工和成熟過程，生成單鏈向導RNA（sgRNA），sgRNA會引導Cas9蛋白精確地剪切并破壞同源間隔區域的DNA鏈，導致雙鏈DNA斷裂（DSB），隨后，細胞會通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）的方式對靶基因進行修復。這一過程中，CRISPR/Cas系統展現出了其精確的靶向干擾能力，從而有效地抵御了外源遺傳物質的入侵。

圖5. CRISPR-Cas9介導的DNA干擾細菌適應性免疫^[5]

RISPR/Cas9基因編輯系統依賴于兩大核心組件：具備導向功能的gRNA和Cas9蛋白。其技術原理涵蓋了兩個基本過程：gRNA引導的Cas9靶向DNA切割，以及隨后的DNA修復。

在Cas9靶向DNA切割階段，CRISPR系統識別DNA上的特定位置，這一識別過程依賴于crRNA（負責識別）和tracrRNA（作為Cas9的結合支架）的序列。當這兩者融合轉錄出sgRNA后，sgRNA與Cas9蛋白結合形成復合體，通過sgRNA與20bp靶序列的互補配對，Cas9核酸內切酶被精確引導至靶切割位點，切割從PAM（即復合體識別的富含GC的三堿基序列，如5′-NGG-3′）上游的第三個堿基開始。Cas9核酸內切酶包含兩個關鍵結構域：HNH核酸酶結構域和RuvC-like核酸酶結構域。這兩個結構域協同工作，共同切割DNA。其中，HNH核酸酶結構域負責切割與crRNA互補的DNA鏈，而RuvC-like結構域則切割另一條非互補鏈。切割位點位于PAM上游原始間隔序列的第3和第4個核苷酸之間，產生平末端的DSB（雙鏈斷裂）。一旦Cas9/sgRNA復合物誘導產生DSBs，機體將啟動兩種修復方式，從而實現對靶基因表達的精準調控。

圖6. CRISPR-Cas9介導的基因編輯機制^[6]

1）非同源末端連接（NHEJ）

非同源末端連接（NHEJ）是修復雙鏈斷裂（DSB）的經典通路。在這一過程中，斷端會經歷核酸酶的精細修剪和DNA聚合酶的空隙填補，然而，這種修復方式會在DNA上留下“痕跡”，可能是修復過程中錯誤插入或缺失的堿基。當這些“痕跡”出現在基因組的編碼蛋白基因區域時，會導致基因編碼的蛋白序列出現異常，進而造成相應蛋白功能的失調。

然而如果“痕跡”出現在基因組的非編碼區，其對細胞的整體功能通常不會造成顯著影響。例如，在基因敲除實驗中，我們常常選擇在翻譯起始位點后的外顯子區域設計gRNA，以確保其盡可能靠近mRNA的5’端。這樣做的目的是，插入或缺失的堿基會干擾正常的密碼子讀碼，導致翻譯過程提前終止，從而破壞目標基因的表達或使其功能喪失。

2）同源重組修復（HDR）

同源重組修復（HDR）是一種基于遺傳重組的DNA修復機制，它發生在兩個相似或相同的DNA分子核苷酸序列之間。HDR的一個顯著特點是，在修復過程中不會引入額外的核苷酸缺失或增加，因此它能夠精確地修復DNA雙鏈的斷裂。例如，在制備疾病相關突變模型時，我們可以通過外源提供包含所需突變的靶基因模板，然后利用HDR機制，在Cas9蛋白切割DNA后，將突變模板精確地整合到基因組中。

CRISPR/Cas技術作為新一代基因編輯技術的代表，具有極為廣闊的應用前景。在本文中，我們向大家介紹了CRISPR/Cas系統的基本組成和編輯機制。而在接下來的文章中，我們將深入探討CRISPR/Cas技術的遞送形式及應用，敬請期待！