重組腺相關病毒（rAAV）上游生產與下游純化過程的優化取決于病毒顆粒關鍵質量屬性的表征。生產后AAV的病毒效價、衣殼含量、空殼率、聚集狀態等都會影響基因治療產品的效力、純度和安全性。所以快速、準確的AAV分析表征，可增強產品質量的理解，并優化生產參數。

為了更全面表征AAV病毒載體，qPCR、ELISA、TEM等都是常用的分析方法。與此同時，分析型超速離心技術（SV-AUC）也已成為確定Z佳生產和純化工藝及監測rAAV載體屬性以確保其質量的關鍵工具。

圖1  AAV關鍵質量屬性的表征^【1】

分析型超速離心技術（Analytical Ultracentrifugation，AUC）是表征生物大分子特性、研究生物分子理化性質的主要技術手段之一，用于分析樣品異質性、聚集體的形成以及分子間相互作用等。貝克曼推出的Optima AUC分析型超速離心機由主機、光學系統、轉頭以及樣本池組件等構成，可以想象成是一臺制備型超速離心機和光學檢測系統的結合，但不同于制備型離心機，Optima AUC作為分析型儀器可以實時監測樣品沉降過程中溶質濃度隨時間和距離的改變，從而計算得到分子特性，例如沉降系數等。

正如圖2所示，AUC檢測時直接將溶液中的樣品放入樣品池中，然后置于轉子內放入腔體離心，通過光學檢測器收集樣品濃度隨時間實時變化的數據。檢測前不需對樣品進行標記和處理，收集原始數據后通過SEDFIT軟件進行數據處理，得到c(s)分布曲線。在c(s)分布曲線中，橫坐標表示樣品中不同顆粒的沉降系數，同時對樣品峰峰面積進行積分，可得到相應的百分含量。

圖2  AUC樣品檢測流程

對于rAAV重組腺相關病毒樣品來說，由于溶液中空殼顆粒、實心顆粒以及中間產物中，病毒顆粒內核酸長度的不同，其沉降系數存在較大差異。在PBS溶液中，AAV空殼顆粒沉降系數約為60S-64S，實心顆粒依據包裹核酸長度的不同，沉降系數分布在75S-110S之間，大于120S的峰我們一般認為是病毒顆粒的聚集體。如圖3所示，AUC檢測分析后，可以區分量化樣品中的多個組分，包括空病毒顆粒、包含全基因組的病毒顆粒、包括部分基因組的病毒載體，以及載體碎片與聚集體等。通過監測AAV載體的性質，可以篩選確定Z佳生產和純化工藝、監測批次間一致性等，確保rAAV載體質量。

圖3  AUC數據分析結果^【2】

與檢測AAV病毒載體空殼率的其它相比，分析型超速離心技術具備：

●高分辨率，wei一可檢測中間產物及其含量的方法，是表征AAV病毒載體的金標準；

●定量檢測，精確測定。與電鏡、qPCR/ELISA、光密度法等估算方法相比，AUC可以做到準確定量，百分含量檢測可達千分之一。

●直接檢測，無需對樣品進行標記，無需標準品，檢測結果更接近于真實狀態。

●方法簡便，同一方法適用于不同血清型的AAV載體，無需再進行方法開發。

參考文獻

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