多重免疫熒光染色，也被稱作酪胺信號放大（Tyramide Signal Amplification, TSA）技術，是一種利用辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。這項技術基于酪胺信號放大的多重順次免疫染色技術，允許同時檢測單個細胞或組織樣本上的多個目標靶點，全面研究細胞組成、細胞功能和細胞間相互作用。TSA利用基于IHC免疫組化的“<一抗-二抗-HRP＞底物”原理及步驟，它所攜帶的辣根過氧化物酶（HRP），能夠在過氧化氫（H?O?）的催化下，促使酪酰胺分子發生活化與沉積。這些沉積的酪酰胺分子就像無數個信號增強器，與熒光基團或其他標記物緊密相連，從而將微弱的信號大幅放大，讓原本難以察覺的目標分子清晰地呈現在研究者眼前。

● 信號放大與檢測靈敏度高：顯著增強熒光信號，其放大倍數約為普通熒光的3-10倍。

● 多色標記能力強：可在同一組織切片上實現多種蛋白或核酸的共染色。

● 抗體種屬來源不受限：在實驗過程中，每一輪染色后可將上一輪的一抗和二抗洗掉，再進行下一輪染色，因此一抗的種屬來源不會對后續染色產生影響，為實驗設計和操作提供了更大的靈活性。

● 熒光穩定性好：熒光素穩定性高，不易淬滅，在實驗操作過程中無需嚴格避光，染色后的玻片可保存數月之久。

1. 免疫熒光和免疫組化—TSA技術能夠實現高靈敏度檢測和多重染色

2. 原位雜交—通過結合特定探針，TSA可以進行RNA定位并提高信噪比

3. 流式細胞術—細胞表面標志物分析：TSA可用于放大流式細胞術中細胞表面標志物的信號，更加精確地區分不同的細胞群。

4. DNA修復與損傷標記：TSA技術可用于標記和量化DNA損傷修復蛋白

5. 蛋白質相互作用研究—鄰近連接試驗（PLA）：在研究蛋白質之間的相互作用時，TSA可以用來放大鄰近連接事件產生的信號，提供更高的分辨率和靈敏度。

6. 生物傳感和診斷—疾病標志物檢測：利用TSA技術開發的生物傳感器可以在早期階段檢測疾病相關的生物標志物，有助于疾病的預防和治療。

7. 神經科學—神經遞質和受體分布：TSA技術能幫助科學家更好地理解大腦中各種神經遞質及其受體的空間分布情況。

8、空間組學：TSA染料能夠提供細胞和組織中分子表達的空間分辨率信息。空間組學結合了基因組學、蛋白質組學和其他組學技術，以保留樣本原始空間結構的方式分析生物分子。

優化條件：為了獲得最佳結果，可能需要對一抗濃度、孵育時間以及TSA底物濃度等多個參數進行優化。

控制背景：雖然TSA提高了信號強度，但同時也可能導致非特異性背景增加。因此，選擇合適的封閉劑和清洗步驟是減少背景的關鍵。

避免過度放大：有時過量的信號放大可能會掩蓋真實的生物信息，所以應該謹慎調整放大倍數，確保結果的真實性和可靠性。

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