遺傳霉素（Geneticin，G418）是一種氨基糖苷類抗生素，它通過與原核和真核細胞的70S和80S核糖體結合，阻斷肽鏈延伸，從而抑制蛋白質合成。這一機制對包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞等都有毒性。當細胞成功轉染并整合含有新霉素抗性基因（如neo基因）后，該基因編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶（APH(3)II）能夠共價修飾G418，使其失活，從而賦予細胞在含有G418的選擇性培養基中生長的抗性。

在分子遺傳試驗中，G418是穩定轉染常用的抗性篩選試劑之一。

G418通過抑制蛋白合成，用于篩選含有抗性基因（如neo基因）的細胞。抗性基因編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶能使G418失活，從而賦予細胞對G418的抗性。通常情況，哺乳動物細胞篩選范圍是200-2000 μg/mL，最常用的工作濃度為100-700 μg/mL。其中植物細胞是10-100 μg/mL；酵母細胞是500-1000 μg/mL，以下是一些細胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

在細胞培養過程中，G418用于篩選能夠抵抗該抗生素的細胞，這些細胞通常攜帶有特定的抗性基因。

1）活力單位的換算
根據此公式進行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對應的質檢報告，或者瓶子上的標簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實際稱重的粉末與體積比濃度。
比如若所用批次的G418 活力值為：750 U/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.67 mg/mL。
如果配制10 mL的G418儲存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取666.7 mg粉末。
2）除菌和保存
根據上述換算得到的實際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內使其完全溶解。
先用5 mL無菌去離子水預濕潤0.22 μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩定。

1) 第一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上，37℃，CO₂培養過夜；
2) 根據細胞類型，設定合適范圍內的濃度梯度，至少選擇6個濃度（處理分裂期的細胞時G418的活性最強，因此在添加G418之前需要讓細胞培養一段時間），以哺乳動物細胞為例，可設定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3) 第二天：去除舊的培養基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基，每個濃度做三個平行孔。
4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養基。
5) 按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數細胞的最低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。

1）轉染48 h后，用含有適當濃度的G418篩選培養基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養液。

3）篩選7天后觀察并評估細胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決于宿主細胞類型，轉染以及篩選效果。

4）挑取并轉移5-10個抗性克隆于35 mm細胞培養板，繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。

5）之后更換正常培養基培養即可。

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圖1.不同批次間基因組霉素有效濃度的穩定性試驗和驗證

注意事項

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