ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合，檢測過程中，通常使用洗板的方式去除非結(jié)合物，最終酶促反應(yīng)后的底物的顏色，對樣本中蛋白進(jìn)行定性與定量。

1.抗體：單抗特異性強(qiáng)，多抗結(jié)合性高，高端試劑盒需要高效的配對。
2.抗原：大多為重組蛋白,細(xì)胞因子和待測樣本，高效標(biāo)準(zhǔn)品需NIBSC/WHO校準(zhǔn)。
3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強(qiáng)度熒光。

圖1：ELISA常用試劑示意圖

根據(jù)試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法，按照原理及操作，市面最常用的方法有：

是檢測抗體最常用的方法，原理為利用酶標(biāo)記的二抗以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，顯色測定。優(yōu)勢在于待測一抗無需標(biāo)記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似，區(qū)別在于一抗酶標(biāo)，檢測孵育也以抗原為主，但直接法ELISA的靈敏度有限，需權(quán)衡使用。

圖2：間接法ELISA示意圖

又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA，原理相似，用于檢測抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例，捕獲抗體包被在固相載體上，加入抗原或待測樣本結(jié)合，后加入的檢測抗體結(jié)合在抗原上，形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。

圖3：雙抗夾心法ELISA示意圖

小分子抗原與半抗原的檢測方法常用競爭法ELISA，待檢樣本中抗原越多，被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量會(huì)減少，彼此形成競爭負(fù)相關(guān)體系，顯色物質(zhì)也就越少，根據(jù)顯色物質(zhì)的比例可擬合得到待測抗原含量。

圖4：競爭法ELISA示意圖

a.免疫抑制法測ELISA：固相包被抗原，被檢樣本對底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比，二者之差為待測抗原含量，原理類似與競爭法ELISA。
b.阻斷ELISA：目的檢測特異性抗體，也稱為競爭ELISA，原理為固相包被抗原，待測樣本與一抗酶標(biāo)競爭孵育，待檢樣本中抗體越多，顯色越淺，反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中涉及該法。
c.此外有用于檢測IgM抗體的抗體捕捉ELISA，有固相載體改變的Dot-ELISA（硝酸纖維素膜）和C-ELISA（滌綸布），還有技術(shù)分類的TRFIA和多因子檢測等。

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定評估，分析如下：

ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定評估，分析如下：

a.回收率：測定試劑盒對數(shù)據(jù)真實(shí)性的校準(zhǔn)，過高或偏低會(huì)產(chǎn)生加樣和假性性的失準(zhǔn)數(shù)據(jù)。
b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準(zhǔn)確性，過高或偏低均會(huì)出現(xiàn)測定的偏差。

a.板內(nèi)精確度：評價(jià)單次實(shí)驗(yàn)中，同一個(gè)已知濃度不同復(fù)孔的差異。
b.板間精確度：評價(jià)同一樣本，多次實(shí)驗(yàn)的差異。

最低檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應(yīng)的最低濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結(jié)果。

圖5：ELISA試劑盒產(chǎn)品分類

ELISA技術(shù)是特定靶標(biāo)蛋白質(zhì)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，提供快速，穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果。可以對生物大分子/小分子的定量，對親和力測定評價(jià)或者篩選，還可對重組蛋白或細(xì)胞因子進(jìn)行活性比對分析等運(yùn)用。常應(yīng)用于細(xì)胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時(shí)應(yīng)用于癌癥、干細(xì)胞、免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的靶標(biāo)。

圖6：ELISA的技術(shù)應(yīng)用

在生物醫(yī)藥研究，細(xì)菌疾病和臨床診斷中，ELISA作為成熟免疫的檢測方法定量檢測出所需研究的細(xì)胞因子，抗原等物質(zhì)，應(yīng)用十分廣泛，了解ELISA并選擇合適的試劑盒，會(huì)讓研究事半功倍。

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