肺癌位居全球癌癥死亡數(shù)榜首和新增數(shù)第二位，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的80%。對(duì)于缺乏驅(qū)動(dòng)突變（如EGFR、 ALK）的晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI），如針對(duì)程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）和程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）的抗體，已經(jīng)徹底改變了肺癌治療的方式。

四種上市的 PD-L1 IHC 檢測(cè)方法，分別為 pembrolizumab、nivolumab、atezolizumab 和 durvalumab共同開(kāi)發(fā)，并已被批準(zhǔn)作為相應(yīng)藥物的伴隨或補(bǔ)充診斷³。

細(xì)胞外囊泡（EVs）或許就是解決這類難題的生物標(biāo)志物來(lái)源。這些小的膜顆粒由所有活細(xì)胞釋放，并通過(guò)攜帶特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸（例如，DNA、RNA），從分泌細(xì)胞傳遞到周圍細(xì)胞，從而介導(dǎo)細(xì)胞間通信。腫瘤細(xì)胞同樣會(huì)向外周血液中排放數(shù)量眾多的EVs，將EVs作為新型癌癥生物標(biāo)志物在臨床常規(guī)檢測(cè)中具有廣闊的前景⁴。

近日，來(lái)自德國(guó)的研究人員在J Extracell Vesicles雜志上發(fā)表文章，報(bào)道了腫瘤相關(guān)的細(xì)胞外囊泡（EVs）用于預(yù)測(cè)tPD-L1低或缺失的患者對(duì)免疫療法的反應(yīng)⁵。

目前認(rèn)為有兩種不同的EV群體：直徑在50-150 nm之間的小EVs（sEVs，以前被稱為“外泌體”）和直徑在100-1000 nm之間的大EVs（lEVs，以前被稱為“微囊泡”）。由于lEVs體積較大，更易用于常見(jiàn)的診斷工具（如流式細(xì)胞術(shù)）進(jìn)行分離和分析。該研究正是試圖選擇lEVs作為研究對(duì)象。

腫瘤抗原在lEV上高度表達(dá)。9種腫瘤抗原在5種NSCLC細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物、lev或sev中的表達(dá)情況（僅展示H596一種細(xì)胞系結(jié)果）。actitin‐4作為lEV標(biāo)記物。

作者首先分離并表征了五種不同分子亞型 NSCLC 細(xì)胞系中腫瘤相關(guān)抗原在 lEV 和 sEV 上表達(dá)的差異。結(jié)果表明lEV上存在的全部腫瘤相關(guān)抗原，其中一些甚至比sEV的水平要高得多。確定了lEV作為后續(xù)研究的可能性。

從 NSCLC 患者血漿中分離的 lEV 和 sEV 的 電鏡照片（左）和NTA對(duì)比（右）結(jié)果，健康對(duì)照（CTLh）、非癌癥對(duì)照（CTLnc）和非小細(xì)胞肺癌患者。

作者接著從NSCLC患者血漿中分離出sEV和lEV，排除血漿脂蛋白對(duì)lEV的嚴(yán)重污染可能性后。通過(guò)NTA、western blot，發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者外周血中l(wèi)EV的濃度和大小與對(duì)照組相比沒(méi)有變化。

NSCLC 患者血液中腫瘤抗原負(fù)載的 lEV升高情況。（A）流式細(xì)胞術(shù)顯示PD-L1和EMMPRIN腫瘤抗原陽(yáng)性的 lEV數(shù)量變化Z顯著。（B） 從 NSCLC 患者和健康對(duì)照中分離的 lEV 中 EMMPRIN 和 PD-L1 表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。（C）ROC 曲線用于確定單獨(dú)升高的腫瘤抗原lEV或所有六種聯(lián)合抗原的鑒別能力。

進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明NSCLC患者血液中PD-L1和EMMPRIN 陽(yáng)性lEV的水平顯著增加，且兩者呈正相關(guān)。而MUC1、ROR1、ROR2、EGFR陽(yáng)性lEV與正常組也有差異性。免疫印跡的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這種富集。通過(guò)ROC分析表明，EMMPRIN單獨(dú)預(yù)測(cè)Z佳，AUC為0.75（95%CI：0.66‐0.84）。而所有六個(gè)標(biāo)志物的組合預(yù)測(cè)則更準(zhǔn)確， AUC為0.80（95%CI：0.69-0.90）。該結(jié)果表明lEV相關(guān)腫瘤抗原具有作為NSCLC患者診斷生物標(biāo)志物的潛力。

（a）根據(jù)血液中腫瘤抗原陽(yáng)性PD-L1 lEVs的數(shù)量，繪制了NSCLC患者的Kaplan–Meier生存曲線。(b)初次診斷時(shí)未治療的NSCL患者與 3 個(gè)月（R/NR3）或 6 個(gè)月（R/NR6）CT分期時(shí)血液中 PD-L1陽(yáng)性 lEV 水平對(duì)比，如果患者表現(xiàn)出完全或部分緩解或疾病穩(wěn)定，則將其分層為應(yīng)答者 （R），如果患者表現(xiàn)出疾病進(jìn)展的跡象，則將其分層為無(wú)應(yīng)答者 （NR）。左圖包括所有接受治療的患者，右圖為治療方案中包含免疫治療的患者。

接下來(lái)，作者研究了NSCLC患者血漿中PD-L1、EMMPRIN、EGFR、MUC1、ROR1和ROR2 lEVs的增加是否會(huì)影響患者的生存率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血液中只有PD-L1 lEVs含量高的NSCLC患者甚至表現(xiàn)出明顯更好的OS。同時(shí)，在進(jìn)行相應(yīng)的化學(xué)免疫治療（CIT，n = 37）， 單免疫治療（Mono-ICI，n = 14）或靶向治療（TT，n = 9）之后，與未應(yīng)答組相比，應(yīng)答者的PD-L1 lEVs水平明顯更高，而其他抗原相關(guān)lEVs未見(jiàn)顯著變化。

（e） NSCLC患者根據(jù)其組織PD-L1（tPD-L1）表達(dá)進(jìn)行分組。在治療 3 或 6 個(gè)月后S次分期 CT 中被歸類為 R 或 NR 的患者中，比較單獨(dú)化療 （CIT） 或聯(lián)合單免疫療法 （ICI） 前 PD-L1 lEV 的水平。（g）ROC 分析比較PD-L1 lEV按 tPD-L1 水平分組患者中的預(yù)測(cè)能力。

tPD‐L1在常規(guī)臨床診斷中被用作預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。然而，tPD‐L1水平低或缺失(分別<49%或<1%)的晚期NSCLC患者也可以從免疫治療中獲益。而tPD-L1水平和腫瘤比例評(píng)分（TPS）均未與同一患者PD-L1 lEV的水平具有相關(guān)性。而在根據(jù)患者的 tPD-L1 水平對(duì)患者進(jìn)行分組后，在tPD-L1表達(dá)缺失組（＜1%）和tPD-L1低表達(dá)的患者（1-49%）中，檢測(cè)到應(yīng)答者的PD-L1 lEV水平明顯高于非應(yīng)答者，相比之下，高tPD-L1（>49%）的患者則沒(méi)有這種差異。ROC的結(jié)果也表明PD-L1 lEV對(duì)于治療效果的預(yù)測(cè)能力在 PD-L1 缺失組 （AUC 0.91;p = 0.01）和低組（AUC 0.90;p = 0.09）極其優(yōu)異，而對(duì) tPD-L1-高患者的預(yù)測(cè)能力相當(dāng)?shù)?（AUC 0.57;p = 0.64）。

總之，該研究結(jié)果將血漿 lEV 上的 PD-L1 確定為一種新的生物標(biāo)志物，可以預(yù)測(cè) tPD-L1 表達(dá)低或缺失的 NSCLC 患者對(duì)免疫治療的反應(yīng)。

在37°C和5% CO₂的條件下，用補(bǔ)充了10%熱滅活（56°C，30分鐘）胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人源NSCLC細(xì)胞系（ATCC，DSMZ）。為分離EVs，排除支原體污染的細(xì)胞（6xT175培養(yǎng)瓶，貼壁率60-80%）用PBS洗滌兩次，然后在RPMI-1640中培養(yǎng)24小時(shí)，該RPMI-1640補(bǔ)充了10%的EV-去除 FCS（在4°C下離心16小時(shí)，153,700 g，并通過(guò)0.2μm濾器過(guò)濾，以去除胎牛血清所含EV）。收集上清液在500 g離心5分鐘，然后1,500 g離心15分鐘以去除殘留的細(xì)胞和碎片。然后在17,000 g離心30分鐘收集lEVs沉淀，上清液繼續(xù)在143,000 g離心90分鐘以收集sEVs沉淀。用PBS洗滌EVs一次并用于下游分析。使用差速超速離心法從Z多15毫升的EDTA抗凝血進(jìn)行EV分離。所有EV顆粒在PBS中洗滌一次并儲(chǔ)存在PBS中以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)⁷。