KTA蛋白層析系統(tǒng)延遲體積的確定與設(shè)置
?KTA蛋白層析系統(tǒng)的流路自身包含一定管路體積，這部分管路體積又稱為延遲體積。延遲體積依據(jù)位置不同可以分為梯度延遲體積和收集延遲體積，本文將對以上兩種延遲體積定義、延遲體積確定方法和UNICORN系統(tǒng)中延遲體積的設(shè)置進(jìn)行詳細(xì)介紹。
梯度延遲體積（Gradient delay volume）
梯度延遲體積是指設(shè)置梯度程序時(shí)混合池與層析柱入口之間的體積，這部分管路體積會導(dǎo)致層析柱中真實(shí)梯度與程序中的梯度 (%B curve) 出現(xiàn)一定的延遲（圖1）。梯度延遲體積可以通過理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)測定的方法獲得，在使用特定混合器的層析系統(tǒng)中梯度延遲體積是一個(gè)定值，不會隨著使用層析柱體積大小發(fā)生改變。對于離子交換等通過拉梯度方式進(jìn)行洗脫的層析方法，進(jìn)行梯度優(yōu)化時(shí)尤其要注意，樣品洗脫峰對應(yīng)B%濃度，是此時(shí)混合池正在混合的梯度，并非樣品被洗脫當(dāng)時(shí)進(jìn)入柱子的B%鹽濃度。此時(shí)，可以用開始給混合池梯度命令（綠色線起點(diǎn)）和電導(dǎo)檢測器檢測到電導(dǎo)值開始增加（藍(lán)色線起點(diǎn)）之間的體積差，近似作為梯度延遲體積，用于倒推樣品洗脫時(shí)對應(yīng)的B%濃度。
圖1. 真實(shí)梯度（藍(lán)色）對比程序梯度（綠色）
收集延遲體積（Fraction delay volume）
?KTA系統(tǒng)收集延遲體積指UV檢測器到樣品收集器或者UV檢測器與outlet之間管路的體積（圖2）。
圖2. 蛋白層析系統(tǒng)?KTA系統(tǒng)延遲示意圖
?KTA蛋白層析系統(tǒng)收集樣品時(shí)，需要在系統(tǒng)中準(zhǔn)確設(shè)置收集延遲體積，從而避免因?yàn)槭占舆t體積錯(cuò)誤，造成?KTA紫外峰圖顯示的樣品出峰位置與對應(yīng)的收集管發(fā)生錯(cuò)位的現(xiàn)象（圖3）。圖3中（a）圖沒有收集設(shè)置延遲體積導(dǎo)致SDS-PAGE膠圖與UV峰圖相比出現(xiàn)滯后現(xiàn)象；而（b）圖中準(zhǔn)確設(shè)置收集延遲體積，SDS-PAGE膠圖與UV峰圖可以較好的進(jìn)行對應(yīng)[1]。
圖3. 系統(tǒng)延遲體積設(shè)置對收集位置的影響[1]
收集延遲體積確定方法
系統(tǒng)延遲體積可以通過理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)測定的方法進(jìn)行確定，以下將對兩種延遲體積確定方法分別進(jìn)行介紹。
收集延遲體積理論計(jì)算方法
理論計(jì)算是獲得延遲體積較簡便方便的方法，延遲體積理論計(jì)算包括以下3個(gè)步驟：
1
確定設(shè)備系統(tǒng)流路中所有成分部件。
2
查表確定系統(tǒng)流路中各個(gè)硬件單元（?KTA pure User Manual 9.14章節(jié)）和單位長度管路對應(yīng)體積（表1）。
3
計(jì)算系統(tǒng)延遲體積：將混合池體積與連接層析柱管路體積相加即獲得梯度延遲體積；將UV檢測器樣品流通池的1/2體積（UV檢測器檢測點(diǎn)為流通池中心區(qū)域）與流路中其它硬件與管路的體積進(jìn)行加和，得到收集延遲體積。
表1. ?KTA系統(tǒng)不同內(nèi)徑管路應(yīng)用及單位長度管路內(nèi)部體積
收集延遲體積的實(shí)驗(yàn)測定方法
UV吸收值測定法
連接F9-R和F9-T收集器的?KTA pure系統(tǒng)（圖3）可以通過UV吸收值測定的方法得到，通過測定V1（樣品入口與UV檢測器之間體積）、V2（樣品入口到收集器樣品出口端之間的體積），計(jì)算V2-V1+1/2V（V為UV檢測器流通池體積）獲得延遲體積[2][3]。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
1
設(shè)置系統(tǒng)流速1 ml/min（如果流速不準(zhǔn)確，檢查系統(tǒng)泵是否進(jìn)氣，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)前確定流速的準(zhǔn)確性）。
2
使用1%-5%丙酮溶液充滿樣品環(huán)（例：樣品體積100 μl）。
3
設(shè)置UV檢測器到收集器之間所有部件為bypass模式。
4
用水充滿系統(tǒng)管路，設(shè)置流速1 ml/min，用樣品環(huán)中丙酮溶液為樣品上樣。
5
計(jì)算從樣品注入點(diǎn)開始到層析圖譜紫外吸收Z高點(diǎn)流路體積，即為V1。
6
重新配置系統(tǒng)流路，將收集器置于UV檢測器之前。斷開UV檢測器兩端管路，用死體積較小的連接頭將兩端管路連接起來。收集器出口管路連入U(xiǎn)V檢測器，UV檢測器出口端接入廢液口Waste。
7
設(shè)置一個(gè)較大的收集體積（比如100 ml），保證實(shí)驗(yàn)過程中樣品從收集口流出。
8
設(shè)置流速1 ml/min，加入樣品丙酮溶液。
9
計(jì)算從樣品注入點(diǎn)開始到層析圖譜紫外吸收Z高點(diǎn)流路體積，即為V2。
10
依據(jù)公式計(jì)算V2-V1+1/2V（V為UV檢測器流通池體積），獲得延遲體積。
圖4. （A） ?KTA pure蛋白層析系統(tǒng)（B）F9-R收集器（C）F9-T收集器
稱重法
通過稱量水的重量測定收集延遲體積（容器重量需要預(yù)先稱重）[3]。
1
設(shè)置系統(tǒng)流路從UV流通池直接流向收集器。
2
用魯爾接頭替換UV檢測器入口接管。
3
用注射器將UV流通池到收集器尖端整個(gè)管路用水充滿。
4
使用注射器用空氣將UV流通池到收集器尖端整個(gè)管路中的水完全替換出來。
5
通過稱量水的重量測定收集延遲體積。
6
重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值。
標(biāo)準(zhǔn)配置的?KTA pure收集延遲體積
標(biāo)準(zhǔn)配置、使用標(biāo)準(zhǔn)長度管路的?KTA pure設(shè)備，其設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)延遲體積數(shù)據(jù)已在?KTA pure使用手冊中列出。手冊中延遲體積數(shù)據(jù)是依據(jù)U9-M紫外檢測器計(jì)算，如果使用U9-L紫外檢測器需要在此體積基礎(chǔ)上加9μl （2mm流通池）、4μl（5mm流通池）。
標(biāo)準(zhǔn)配置?KTA pure Micro/Micro kit配置微量紫外檢測器、微量電導(dǎo)檢測器和微量出口閥。
標(biāo)準(zhǔn)配置的?KTA pure系統(tǒng)可以通過查詢對應(yīng)表格（表2、表3和表4）得到標(biāo)準(zhǔn)配置設(shè)備收集延遲體積信息。
其他型號標(biāo)準(zhǔn)配置的?KTA蛋白層析系統(tǒng)也可以通過查詢使用手冊獲得設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)收集延遲體積。
表2. ?KTA pure25收集延遲體積
表3. ?KTA pure Micro/Micro kit收集延遲體積
表4. ?KTA pure 150收集延遲體積
UNICORN系統(tǒng)中收集延遲體積的設(shè)置
UNICORN系統(tǒng)中可以設(shè)置UV檢測器到Outlet閥及UV檢測器到收集器之間的延遲體積（圖4），具體設(shè)置步驟如下：
1
在System Control界面選擇System-Settings，打開System Settings對話框。
2
點(diǎn)擊 Fraction collection →Delay volumes。
3
在Detector-Frac 中輸入U(xiǎn)V檢測器到收集器之間的延遲體積數(shù)值；在 Detector – Outlet中輸入U(xiǎn)V檢測器到出口閥之間的延遲體積數(shù)值。
圖4. UNICORN系統(tǒng)延遲體積的設(shè)置界面
需要說明的是不同型號的?KTA蛋白層析系統(tǒng)延遲體積的確定和設(shè)置方法，操作細(xì)節(jié)上可能存在細(xì)微差別，具體設(shè)置方法可以查看對應(yīng)型號產(chǎn)品的使用手冊。
參考文獻(xiàn)：
1. 蘆亞菲. 《蛋白質(zhì)制備與鑒定平臺蛋白層析系統(tǒng)介紹》清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心蛋白質(zhì)制備與鑒定平臺 2020/05/16 https://phoenix.tsinghua.edu.cn/index.php?c=show&id=519
2. ?KTA pure User Manual 29119969 AE
3. ?KTA Laboratory-scale Chromatography Systems CY13989-02Dec20-HB. Appendix 3 Determination of delay volumes
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