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超微量分光光度計檢測方法研究

來源:上海美析儀器有限公司      分類:應用方案 2024-03-19 10:45:04 123閱讀次數(shù)
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第一部分:摘要

摘要:超微量分光光度計目前成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器,廣泛應用于生命科學實驗室蛋白質組學和基因組學等領域。應用液體的表面張力特性,檢測時經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑,達到快速、微量、高濃度檢測吸光度的特點。本文闡述了如何用現(xiàn)有的國家標準物質對超微量分光光度計進行檢測,并舉例說明對超微量分光光度計透射比、波長和雜散光等主要指標檢測方法。Z后對超微量分光光度計日常檢測過程中可能遇到的問題并對其進行分析。


分光光度計是一類重要的分析儀器,無論在物理學、化學、生物學、醫(yī)學、材料學、環(huán)境科學等研究領域 ,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金等現(xiàn)代生產與管理部門 ,紫外可見分光光度計都有廣泛而重要的應用。分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。由于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量樣本量很小,于是超微量分光光度計應運而生。


目前超微量分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器,應用液體的表面張力特性,樣品體積只需要0.52μL,在檢測臺上,經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑達到快速、微量、高濃度及不用石英管、毛細管等耗材檢測吸光度的特點,被廣泛應用于生命科學實驗室蛋白質組學和基因組學等領域。

02


第二部分:區(qū)別
 

超微量分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成,與傳統(tǒng)分光光度計有明顯的不同。二者有以下7點區(qū)別:

(1)所需樣品體積小,僅需0.5 ~2μL;

(2)不需要比色皿,用移液槍直接將樣品滴加到檢測平臺上,測量時樣品自動形成液柱,檢測完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測平臺上擦拭干凈即可;

(3)一般具有1mm和0.2mm兩個光程(電機控制自動選擇),而傳統(tǒng)分光光度計的光程為10mm,分光光度計樣品無需稀釋,測量范圍可達到常規(guī)分光光度計的50倍;

(4)氙氣閃光燈為燈源,代替了氘燈(紫外)和鎢燈(可見),使用壽命更長;

(5)不需要預熱,可隨時檢測;

(6)顯示吸光度值的同時,程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料);

(7)體積比傳統(tǒng)分光光度計小很多(用體積數(shù)值表述)。

03


第三部分: 原理

超微量分光光度計與傳統(tǒng)的紫外可見分光光度計工作原理相同,都是根據(jù)物質的分子對紫外、可見區(qū)輻射()的選擇性吸收和朗伯 - 比爾(Lambert Beer)定律對物質進行定量分析和定性鑒別的儀器。

朗伯 - 比爾定律的數(shù)學表達式為:

A = -lg(I/I 0 )= -lgT = klc

式中:A—物質的吸光度;

I 0 —入射的單色光強度;

I—透射的單色光強度;

T—物質的透射比;

k—物質的吸光系數(shù);

l—被分析物質的光程;

c—物質的濃度。

由此可見,單色光輻射穿過被測物質溶液時,被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度(光程)成正比。物質對光的選擇性吸收波長,以及相應的吸收系數(shù)是該物質的物理常數(shù)。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數(shù)后,可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸光度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。

現(xiàn)行的紫外可見分光光度計檢定依據(jù)為 JJG178-2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》國家計量檢定規(guī)程。其中規(guī)定透射比標準物質:質量分數(shù)為 0.06000/1000重鉻酸鉀的0.001mol/L高氯酸標準溶液。分別在 235nm、257nm、313nm、350nm處測量透射比三次。重鉻酸鉀標準溶液在相應波長下不同溫度的透射比值如表 1 所示。

04


第四部分:檢測方法
 

透射比準確度和重復性的測量

分別在235nm、257nm、313nm、350nm處,將重鉻酸鉀標準溶液[紫外分光光度計溶液標準物質 GBW(E)130066]作為樣本進行測量。

首先,超微量紫外可見分光光度計結果為吸光度值,然而紫外分光光度計溶液標準物質(重鉻酸鉀標準溶液)證書的特性量值用透射比表示。其次,超微量紫外可見分光光度計光徑為1mm 或0.2mm,和紫外分光光度計溶液標準物質內徑為10nm的標準石英吸收池定值條件并不一致。這樣就需要對所測出的結果進行數(shù)據(jù)處理。

由朗伯-比爾定律 A = klc可知,被測物質的光程和吸光度值成正比,可將超微量分光光度計波長為313nm時,光徑為1mm的吸光度值0. 030,擴大10倍,轉化成光徑為10mm的吸光度值為0.300。同理,光徑為 0. 2mm的吸光度值0. 006,擴大50倍,轉化成光徑10mm的吸光度值也為0.300。又根據(jù)朗伯-比爾定律 A=-lgT,可得 T=10-A 。超微量分光光度計波長為 313nm時,T=10-0.300=50.1%。

依據(jù) JJG178-2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》國家計量檢定規(guī)程要求,分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處測量透射比三次。透射比Z大允許誤差≤ ±2. 0%,透射比重復性≤1. 0%,符合Ⅳ級儀器指標要求。

波長準確度的測量

掃描氧化鈥的光譜曲線,依次查找200nm~900nm的指定波長,配合圖譜下方的數(shù)據(jù)列表,找出氧化鈥光譜曲線的波峰值(與其對應的則是光譜曲線透射比的波谷值)。

依據(jù) JJG178-2007規(guī)程的計量性能要求,波長在200nm~340nm區(qū)段,Z大允許誤差≤±2nm,波長在340nm~900nm區(qū)段,Z大允許誤差≤± 4nm,波長重復性≤1nm,符合Ⅳ級儀器指標要求。

雜散光的測量

測量生化分析儀校準用溶液標準物質(BW2025)中的亞硝酸鈉標準溶液(注:溶液濃度為 50g/L) 根據(jù)朗伯-比爾定律,先將儀器測量的吸光度值轉化成光徑為 10mm 的吸光度值:A10nm =10A 1nm = 1. 412×10 =14.12。超微量分光光度計波長為 340nm時雜散光的結果,轉化成 T =10-A=10-14.12=0. 0%。依據(jù) JJG178 -2007規(guī)程的計量性能要求,儀器雜散光(透射比)≤0.1%,符合Ⅰ級儀器指標要求。

常見超微量分光光度計檢測中的問題及分析

超微量分光光度計的零點漂移

用紫外分光光度計標準物質(重鉻酸鉀標準溶液)檢測儀器透射比準確度,分別設置235nm、257nm、313nm、350nm 四點波長,以空白溶液為參比,在對應波長下調零后,用紫外分光標準溶液測量被測儀器的透射比。

測量結果與紫外可見分光光度計標準物質透射比差別較大,且連續(xù)測量3 次,對測量結果的影響不大。

經(jīng)過測量結果數(shù)據(jù)分析,儀器經(jīng)轉化后的透射比結果比標準值小,得出吸光度值原始測量結果則比吸光度的標準值大,其中發(fā)現(xiàn)吸光度的誤差變化成線性,且誤差均是 0.10。

這樣將標準空白溶液當成樣本,測量空白溶液吸光度值,發(fā)現(xiàn)空白溶液的吸光度值為0.010(被測儀器的光徑為1mm)。轉化成光徑為10mm的吸光度對應正好也就相差 0.10。這種方法可以測量出該儀器的零點漂移。把儀器的吸光度的本底減去后符合朗伯 - 比爾定律。


05


第五部分:結束語
 

通過上述的檢測方法闡述和問題分析,對判斷超微量分光光度計的計量性能有了更加可行的手段和方法。依據(jù) JJG178 2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》中的要求,并沒有規(guī)定對超微量分光光度計有效的檢測方法。因此結合計量部門的實際情況,設計一套有效的檢測方法,使得計量標準得到有效的量值傳遞,也同時解決了超微量分光光度計此前無法量值溯源問題,是值得在今后的工作中加以推廣并完善的。


06


第六部分:儀器參數(shù)
 

UL-2000超微量紫外可見分光光度計

1.產品簡介

超微量紫外可見分光光度計是一類很重要的分析儀器 ,無論在物理學、化學、生物學、醫(yī)學、材料學、環(huán)境科學等科學研究領域 ,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金等現(xiàn)代生產與管理部門 ,超微量紫外可見分光光度計都有廣泛而重要的應用。超微量紫外可見分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器,常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。超微量紫外可見分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。

2.儀器特點   

*檢測所需樣微量,Z低只需0.5ul ,超微量和比色皿雙平臺

*檢測范圍寬,比傳統(tǒng)的分光光度計的上限高100倍

*對于多數(shù)樣品而言,無需稀釋

*機器無需預熱,直接測量,無需檢測容器,日常消耗低

*全波長190-1100nm,分辨率1nm,儀器都自動給出全波長的掃描結果190-850nm

*體積小巧,便攜式包裝,滿足現(xiàn)場檢測的需求

*通過PC控制實現(xiàn)更精確和靈活的測量

3.技術指標   

*Z小樣本量:0.5μl

*超微量光程:1mm/0.2mm/0.05mm(可選)

*比色杯光程:10mm/5mm/2mm/1mm

*波長范圍:190~850nm

*波長精度:1 nm

*波長分辨率:≤0.3nm(FWHM 在 Hg 253.7nm)

*吸光率精度:2%(0.76 在 257nm)

*吸光率分辨精度:0.002Abs(1mm 光程)

*吸光率范圍:0.005~300 (等效10mm光程)

*可準確測量范圍:0.01~0.5 Abs.±0.01Abs      0.5~80 Abs. ±2%

*偵測器:3648像素線性CCD陣列

*光源:微型氙氣閃光燈系統(tǒng)

*測量時間:<5 秒

*尺寸:200mm×130mm×136mm(L×W×H)

*重量:≤ 2.5kg

*樣本檢測平臺材質:304 不銹鋼和石英

*輸入電壓:AC100~240V 50~60Hz


07


第七部分:關于我們
   

上海有限公司(以下簡稱美析),是一家具有自主知識產權的高新技術企業(yè),美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”,并以此為企業(yè)宗旨,不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測試儀器領域,不斷開發(fā)出先進的產品,使美析成為優(yōu)質儀器資源的供應者。

美析主營光譜類儀器:可見分光光度計、紫外可見分光光度計、原子吸收光譜儀、原子熒光光度計、ICP-AESICP-MS,生命科學儀器:超微量分光光度計、全自動核酸提取儀,目前,我們的產品已廣泛應用于有機化學、無機化學、生物化學、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農業(yè)等領域。同時美析利用在產品機械結構、光學設計、電氣應用和軟件開發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗,結合市場的Z新實際需求,近期將陸續(xù)推出一批全新的分析類儀器。

美析非常重視人才的引進和培養(yǎng),人的因素是一個企業(yè)可持續(xù)發(fā)展的核心因素,所以美析充分尊重每一位員工,做到真正的“共建平臺,實現(xiàn)自我”。為此美析建立了強大的培訓團隊,對在職員工進行全方位的培訓,幫助員工制定職業(yè)生涯規(guī)劃,以期公司和員工共同發(fā)展。同時美析以“家庭、敬業(yè)、學習”的職業(yè)操守啟迪著員工,每一個美析人都以飽滿的熱情和專業(yè)的技能完,美呈現(xiàn)每一臺儀器、服務每一位客戶。對人才的重視和尊重使公司的各個環(huán)節(jié)都充滿著嚴謹和激情,全新的設計理念、對高精度高參數(shù)的苛刻要求、應用范圍的持續(xù)延伸,所有這些都在我們的產品先進性上得到了完美呈現(xiàn);從原材料的嚴格驗收,到各工藝流程的標準流水線作業(yè),再到質檢部門的嚴格出廠檢測,美析人對生產各環(huán)節(jié)的苛刻要求使得公司建立起一套完善的過程質量控制系統(tǒng),并在儀器的質量上得到有力體現(xiàn)。也因此使我們的產品受到國內外用戶的一致好評。

美析的總部及生產基地設在上海,營銷中心設在北京,并在上海、北京、江蘇三地建有研發(fā)基地。為充分利用各地的智力資源,美析與國內外的部分科研單位也進行了深層次的科研合作,不斷將科研成果轉化為生產力。為更好的服務于廣大客戶,國內設有12家辦事機構,度身定制符合您需求的應用解決方案,提高產品的附加值。在不斷服務國內用戶的同時,美析也與20多個國家的分銷機構建立了深度的戰(zhàn)略合作關系。

伴隨著美析躋身全球品牌儀器行列步伐的加快,美析對自身的要求不斷提高,同時我們也希望能得到社會各界的關愛和支持,讓我們攜手共同展望。科技,必將因你我而改變。

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