1. 凝膠介質的選擇
      凝膠介質的選擇主要是根據待分離的蛋白和雜蛋白的分子量選擇具有相應分離范圍的凝膠，同時還需要考慮到分辨率和穩定性的因素。比如，如果是要將目的蛋白和小分子物質分開，可以根據他們分配系數的差異，選用SephadexG-25和 G-50；對于小肽和低分子量物質的脫鹽，則可以選用Sephadex G-10、G-15以及 Bio-GelP-2 或 P-4；如果是分子量相近的蛋白質，一般選用排阻限度略大于樣品中ZG分子量物質的凝膠。具體凝膠過濾色譜介質應用如下：

2. 凝膠介質的預處理

        凝膠在使用前應用水充分溶脹（膠：水=1：10），自然溶脹的耗時較長，可采用加熱的方法使溶脹加速，即在沸水浴中將凝膠升溫至沸，1~2h即可達到溶脹。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌，靜置，傾去上層混懸液，除去上清液中的凝膠碎塊，重復數次，直到上清澄清為止。

3. 色譜柱的選擇

        色譜柱的體積和高徑比與色譜分離效果密切相關，凝膠柱床的體積、柱長和柱的直徑以及柱比的選擇必須根據樣品的數量，性質和分離目的進行確定。組別分離時，大多采用 2~30cm 長的色譜柱，柱床體積為樣品溶液體積的 5倍以上，柱比一般在 5~10 之間；而分級分離一般需要 100cm 左右的色譜柱，并要求柱床體積大于樣品體積 25倍以上，柱比在20~100之間。

4. 凝膠柱的填裝

    凝膠色譜柱與其它色譜方法不同，溶質分子與固定相之間沒有力的作用，樣品組分的分離完全依賴于他們各自的流速差異。裝住時關住柱子下口，在柱內加入約1/3 柱床體積的水或緩沖液，然后沿著柱子一側將緩沖液中的凝膠攪拌均勻，緩慢并連續的一次性注入柱內。待凝膠沉積約 5厘米左右時，打開柱子下口，控制流速在 1ml/min。

5. 樣品的處理與上樣

    根據樣品的類型和純化分析，需要選擇合適的緩沖液，為了達到良好的分析效果，上樣量必須保持在較小的體積，一般為柱床體積的1%~5%，蛋白質樣品上樣前應進行濃縮，使樣品濃度不大于4%（樣品濃度與分配系數無關），但需要注意的是，較大分子量的物質，溶液粘度會隨濃度增加而增大，使分子運動受限，影響流速。上樣前，樣品要經濾膜過濾或離心，除去可能堵塞色譜柱的雜質。

6. 洗脫與收集

    凝膠過濾色譜的緩沖液用單一緩沖液或含鹽緩沖液作為洗脫液即可，主要考慮倆個方面的原因：蛋白的溶解性和穩定性。所用的緩沖液要保證蛋白質樣品在其中不會變性或沉淀，PH 應選在樣品較穩定、溶解性良好的范圍之內，同時緩沖液中要含有一定的鹽（NaCL），對蛋白質起穩定和保護作用。洗脫過程中始終保持一定的操作壓，流速不可過高，保持在 0.5~3.0mL/min即可。