一、引言

電穿孔技術(shù)是一種利用電場作用改變細(xì)胞膜通透性的技術(shù)，通過脈沖電場的作用，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性穿孔，從而使外源DNA能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這一技術(shù)在轉(zhuǎn)基因和動(dòng)物克隆領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。本文將探討電穿孔技術(shù)在這些領(lǐng)域的應(yīng)用，并通過實(shí)驗(yàn)方法詳細(xì)闡述其操作步驟。

二、電穿孔技術(shù)在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

電穿孔技術(shù)在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在將外源DNA導(dǎo)入各種細(xì)胞中，包括細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。相較于傳統(tǒng)的化學(xué)法，電穿孔技術(shù)具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

• 電轉(zhuǎn)杯：用于容納細(xì)胞和DNA混合液，進(jìn)行電擊操作。

• 脈沖發(fā)生器：提供所需的脈沖電場。

• 細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于細(xì)胞的培養(yǎng)和孵育。

• 顯微鏡：觀察細(xì)胞形態(tài)和存活情況。

• DNA：待轉(zhuǎn)染的外源基因。

• 細(xì)胞：目標(biāo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、大腸桿菌等。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 清洗電轉(zhuǎn)杯：將電轉(zhuǎn)杯置于75%酒精中浸泡2小時(shí)，然后在紫外燈下照射消毒后備用。

2. 細(xì)胞準(zhǔn)備：電穿孔前一天，以合適密度傳代細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前處于對數(shù)生長期。對于原代培養(yǎng)細(xì)胞，一般培養(yǎng)2-3天后，細(xì)胞單層融合度可以達(dá)到70-80%，即可開始試驗(yàn)。

3. 細(xì)胞消化：使用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用胰酶消化細(xì)胞2分鐘，待細(xì)胞變圓后，用10%血清培養(yǎng)基終止消化。

4. 細(xì)胞懸液制備：輕輕吹下細(xì)胞，形成單細(xì)胞懸液，然后1200rpm室溫離心5分鐘。棄去上清液，加無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并上下吹打均勻。此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞量達(dá)到1-3×10^6 cells/ml。

5. DNA混合：加入適量相應(yīng)濃度的待轉(zhuǎn)染核酸至細(xì)胞懸液中，使質(zhì)粒DNA的終濃度為20μg/ml，SiRNA的終濃度為100nM，上下吹打均勻。

6. 電擊操作：將混合液移入相應(yīng)規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯中，按照預(yù)定條件設(shè)置參數(shù)，進(jìn)行電擊操作。不同細(xì)胞電轉(zhuǎn)前，需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索電轉(zhuǎn)的最佳條件，既要保證較高的轉(zhuǎn)染效率，又要保證較高的細(xì)胞存活率。經(jīng)過實(shí)踐摸索后得出，相應(yīng)的最佳參數(shù)為：質(zhì)粒DNA使用250V，10ms，1（最多2）次脈沖，0.4mm電轉(zhuǎn)杯；SiRNA使用250V，5ms，1（最多2）次脈沖，0.4mm電轉(zhuǎn)杯。

7. 細(xì)胞孵育：電擊完成后，將電轉(zhuǎn)杯置于恒溫培養(yǎng)箱中8-12分鐘，以使核酸充分進(jìn)入細(xì)胞。然后將電擊杯從恒溫培養(yǎng)箱中取出，接種細(xì)胞懸液于室溫10%培養(yǎng)基中，上下吹打均勻后，置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。

8. 細(xì)胞觀察和檢測：培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察細(xì)胞存活狀況。48小時(shí)后，即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測或是進(jìn)行細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)處理。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

電穿孔技術(shù)相較于傳統(tǒng)的化學(xué)法，顯示出更高的轉(zhuǎn)染效率。例如，在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化中，電穿孔法可以達(dá)到每微克DNA 1010個(gè)轉(zhuǎn)化體的水平，而化學(xué)法感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高只能達(dá)到每微克DNA 108個(gè)轉(zhuǎn)化體，電穿孔法提高了10-100倍。

三、電穿孔技術(shù)在動(dòng)物克隆中的應(yīng)用

電穿孔技術(shù)在動(dòng)物克隆中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在細(xì)胞核移植和細(xì)胞融合等方面。通過電穿孔技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞的核移植和胚胎的電活化，從而成功克隆出多種動(dòng)物。

3.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

• 顯微操作儀：用于細(xì)胞核的顯微操作。

• 電融合儀：提供細(xì)胞融合所需的脈沖電場。

• 培養(yǎng)箱：用于胚胎的培養(yǎng)和發(fā)育。

• 顯微鏡：觀察細(xì)胞形態(tài)和胚胎發(fā)育情況。

• 卵母細(xì)胞：用于核移植的受體細(xì)胞。

• 供體細(xì)胞：含有待克隆動(dòng)物細(xì)胞核的細(xì)胞。

3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 卵母細(xì)胞準(zhǔn)備：選擇發(fā)育良好的卵母細(xì)胞，去核處理。

2. 供體細(xì)胞核移植：將供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中。

3. 細(xì)胞融合：使用電融合儀進(jìn)行細(xì)胞融合，使供體細(xì)胞核與卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)融合。電融合的條件需要根據(jù)不同種類的細(xì)胞進(jìn)行摸索，通常電場強(qiáng)度在600V/cm到3.6kV/cm之間，脈沖時(shí)間多介于30-250ms之間。

4. 胚胎電活化：使用電穿孔技術(shù)對融合后的胚胎進(jìn)行電活化，使其發(fā)生分裂。電活化的條件也需要根據(jù)具體情況進(jìn)行摸索，通常使用直流方波脈沖。

5. 胚胎培養(yǎng)：將活化后的胚胎移植到代理母親的子宮中，進(jìn)行妊娠和發(fā)育。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

電穿孔技術(shù)在動(dòng)物克隆中取得了顯著成果。例如，通過電穿孔技術(shù)，科學(xué)家成功克隆了綿羊、牛、猴子和小鼠等多種動(dòng)物。這些成果不僅推動(dòng)了動(dòng)物生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究，也為基因工程、基因治療以及單克隆抗體技術(shù)的進(jìn)步提供了重要支持。

四、電穿孔技術(shù)的優(yōu)化與挑戰(zhàn)

盡管電穿孔技術(shù)在轉(zhuǎn)基因和動(dòng)物克隆中取得了顯著成果，但仍存在一些挑戰(zhàn)和需要優(yōu)化的地方。

4.1 電穿孔條件的優(yōu)化

電穿孔的效率受到多種因素的影響，包括電場強(qiáng)度、脈沖波形、脈沖長度、緩沖液以及細(xì)胞類型等。因此，在進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要對這些條件進(jìn)行仔細(xì)摸索和優(yōu)化，以獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。

4.2 細(xì)胞損傷與恢復(fù)

電穿孔過程中，細(xì)胞膜的可逆性穿孔會(huì)對細(xì)胞造成一定的損傷。因此，在電擊后，細(xì)胞需要一定的恢復(fù)時(shí)間。如何減少細(xì)胞損傷并促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)，是電穿孔技術(shù)需要解決的重要問題。

4.3 細(xì)胞類型的適用性

不同種類的細(xì)胞對電穿孔的敏感性不同，有些細(xì)胞可能難以通過電穿孔實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)移或細(xì)胞融合。因此，需要針對不同種類的細(xì)胞進(jìn)行專門的研究和優(yōu)化，以提高電穿孔技術(shù)的適用范圍和效率。

五、結(jié)論與展望

電穿孔技術(shù)在轉(zhuǎn)基因和動(dòng)物克隆中顯示出巨大的潛力和應(yīng)用前景。通過優(yōu)化電穿孔條件、減少細(xì)胞損傷以及提高細(xì)胞類型的適用性，可以進(jìn)一步推動(dòng)這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。