- 2025-01-21 09:33:16細胞系構建
- 細胞系構建是指通過特定方法從原始細胞或組織中培養出具有穩定遺傳特性和生物學功能的細胞群體的過程。這些細胞系常用于生物學、醫學研究及藥物篩選等領域。構建過程中需確保細胞純度、增殖能力及功能特性，常涉及細胞分離、培養條件優化及遺傳操作等技術。細胞系的成功構建為疾病機制的探索、治療方法的開發提供了重要工具。
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細胞系構建問答
- 2023-06-16 14:28:25構建表達載體想降本增效？看這一篇就夠了
- 想要開發有穩定生產能力的細胞株，除了在細胞開發中對于細胞表達能力的評估篩選以外，前期的表達載體的構建過程也非常重要。使用納升移液技術可以顯著提高細胞株過程基因合成，表達載體構建以及轉染篩選等實驗的實驗效率，降低實驗成本。聲波移液展示Echo?移液系統依靠專 利技術（U.S. Patent 6938995）和創新方法改變移液操作在整個生命科學領域中的應用。它采用動態液體分析（Dynamic Fluid Analysis?, DFA）技術和聲波移液（Acoustic Droplet Ejection，ADE）技術，讓研究人員能夠移取多種不同類型的液體，完成微量小體積（2.5/25nL）的移液工作。全流程無需槍頭耗材，無交叉風險。納升移液技術讓細胞株構建更快、更準、更經濟更快—— Echo快速任意孔到任意孔移液，極速基因組裝在質粒構建前期，需要非常多的準備實驗，如基因組裝中將不同的DNA片段混合，在檢測反應中將不同的樣本組合，在NGS文庫構建過程中將多個文庫pooling到一起，在CRISPr基因編輯中構建sgRNA文庫等等，這些實驗都需要進行快速、靈活的加樣移液，就算使用高通量的移液工作站，往往也要好幾小時才能完成。納升移液技術Echo的任意孔到任意孔的快速移液特點則讓此類應用簡單、快速化，每次轉移花費更少時間更短。這為基因組裝節省了高達82%的時間。從母板任意孔轉移任意體積樣品到目標板任意孔中，實現快速挑選、樣品混合和組合。有效縮短實驗周期更準—— Echo加樣精 準，提高克隆效率利用質粒上含有的抗性選擇進行篩選，需要對篩選結果進行鑒定， 而qPCR也是常用的鑒定方法之一。使用Echo納升移液技術進行微量化克隆篩選鑒定，可以以更少的實際成本精 準完成實驗。使用Echo完成 qPCR的反應體系構建，通過減少每個組件的體積，并使用不使用tips的Echo，將反應體積縮小10倍，從10 μL減少到1 μL，成本降低了8倍。精 準減小實驗體積更經濟—— Echo微量化，縮小反應體系，讓新技術更經濟系統化的設計必然會帶來更大的樣本量，從而導致更高的費用， Echo采用聲波的能量進行無接觸式移液，且每滴液滴僅為2.5nL或25nL，因此可以直接省去吸頭耗材的消耗，也可以將檢測反應體系降低4-100倍，使成本急劇下降。有效縮減試劑成本Gibson and Golden Gate Assembly實驗：不同反應體積的成本效益和組裝效率比較產品信息“僅用于科研，不用于臨床診斷”
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- 2022-11-21 10:19:06“沃”的實驗 | 13份動物模型構建方法系列資料上新，造模不再難！
- 在做基礎研究時加入動物實驗不僅會使研究工作更完善，也會提高投稿的命中率，但是想把實驗做成功卻不是件容易的事兒，因為在動物造模中總遇到各種難題：搞不清動物建模標準化的流程，做起實驗磕磕絆絆造模需要注意的細節多，反復摸索十幾遍才造模成功明明按照文獻中的實驗方法造模，卻還老是不成功“沃”的實驗全網最全的生命科學研究線上學習平臺第二期內容：常見疾病動物模型——構建方法系列2幫助大家解決造模中遇到的難題第二期內容有什么？“沃”的實驗——全網最全的生命科學研究線上學習平臺第二期內容，為大家分享常見疾病動物模型構建方法，涵蓋8大視頻課程+2大實驗手冊+3大建模的標準操作流程。5位老師線上為你講解不同動物模型的背景、造模方法等內容，理論結合實踐，希望能給大家的動物建模帶來更多新思路和新靈感。點擊鏈接，即可進入學習 8大視頻課程 2大實驗手冊 3大建模的標準操作流程歡迎大家收藏「“沃”的實驗」線上學習平臺學習平臺，內容將持續更新下期內容預告： 實驗動物手術操作-手術方法
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- 2022-04-18 13:45:53Neuron：北大李毓龍課題組構建一種全新的ATP熒光探針
- 文章概述三磷酸腺苷（Adenosine 50-triphosphate，ATP）是一種廣泛存在于體內的能量存儲分子。除了參與細胞內的能量代謝功能外，越來越多的證據表明，釋放到細胞外空間的ATP可以作為一種分子信號（嘌呤能遞質），能夠結合并激活離子型P2X受體以及代謝型P2Y受體。在神經系統中，釋放的ATP參與了多中生理病理過程，包括痛覺感受、機械/化學感知信號轉導、突觸傳遞、損傷、炎癥等。對于ATP在這些生理過程中的作用，目前的研究并未完全闡明。為了進一步研究ATP的生理功能，2021年12月22日，北京大學生命科學學院李毓龍教授團隊發表在《Neuron》期刊上發表題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文，該項工作展示了團隊最新開發的一種可遺傳編碼的熒光分子探針——GRABATP1.0（簡稱ATP1.0；GRAB：G protein-coupled receptor activation-based sensors），該探針以P2Y受體作為ATP的結合支架，能夠對細胞外的ATP進行高靈敏度、高選擇性以及高時空分辨率的實時測量。該項工作是李毓龍教授團隊在相繼開發了乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素和腺苷等一系列分子探針之后的后又一重要成果，對于我們深入研究并理解ATP的生理功能具有重要意義。核心觀點1、ATP1.0是一個可遺傳編碼的細胞外ATP感受器；2、ATP1.0對于細胞外ATP具有高敏感性和高時空分辨率；3、ATP1.0可用于離體以及在體ATP釋放的實時監測。研究結果分析1. ATP1.0表現出卓越的細胞外ATP檢測性能為了開發一個遺傳編碼的ATP熒光探針，研究者首先系統地篩選了能夠被ATP激活的G蛋白耦合受體（G protein-coupled receptors, GPCRs），包括人源的P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y11、P2Y12和P2Y13等。以這些GPCRs作為支架，研究者將結構敏感的綠色熒光蛋白（circularly permuted enhanced GFP, cpEGFP）插入到這些受體結構中。其中hP2Y1在插入cpEGFP后表現出最佳的膜轉運和對ATP的響應性，因此隨后研究者選擇了基于hP2Y1的嵌合體ATP0.1進行進一步優化，并且最終得到了對ATP熒光響應性最 好的ATP1.0。當ATP1.0在HEK293T細胞中表達時，它能夠很好的被運輸到細胞膜上表達，并對細胞外100mM的ATP產生一個~500%的dF/F0峰值。在特異性方面，ATP1.0對細胞外ATP的反應能夠被P2Y1的拮抗劑MRS-2500阻斷。ATP1.0對其它遞質不會產生反應，包括谷氨酸、GABA、甘氨酸、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素、組胺和乙酰膽堿等，對二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP）的反應與ATP類似，但是對于其它結構類似的嘌呤能分子或衍生物，如一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷等幾乎不產生反應。ATP1.0的反應具有快速動力學的特征，其反應平均上升時間常數約為28 ms，平均衰減時間常數約為283 ms。在熒光強度上，ATP1.0被ATP激活時的亮度達到了直接表達hP2Y1-EGFP融合蛋白熒光強度的64%，并且ATP1.0在單光子激發下的光譜與EGFP相似，激發峰在500 nm，發射峰在520 nm。在與其它細胞外ATP分子探針的比較中，ATP1.0表現出更大的動態檢測范圍、更強的熒光反應、以及更低的信噪比。接下來，研究者探討了ATP1.0在原代培養的星形膠質細胞和神經元中的表達能力以及反應性。ATP1.0能夠廣泛的表達到星形膠質細胞和神經元的細胞上，包括胞體、突起等部位。表達到星形膠質細胞和神經元上的ATP1.0對細胞外ATP均有較好的反應，其平均dF/F0峰值分別約為1000%和780%。此外，ATP誘導的熒光反應也能夠被P2Y1、受體拮抗劑MRS-2500阻斷。此外，與HEK293T中結果相似，神經元中表達的ATP1.0對ATP和ADP均有反應，但對一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷均無反應。更重要的是，ATP1.0在細胞表面非常穩定，在給予10mM 的ATP 兩小時后，表達ATP1.0的神經元的熒光沒有出現明顯下降。綜上所述，ATP1.0能夠適用于多種類型的細胞，對細胞外的ATP產生高靈敏度、高選擇性和高穩定性的熒光增強反應。2. ATP1.0可用于監測體外培養細胞外的ATP水平接下來，研究者測試了ATP1.0是否能夠用于檢測神經-膠質共培養細胞中內源性ATP的釋放。在大腦中，機械刺激和細胞腫脹均能誘發胞內ATP被釋放。在表達ATP1.0的細胞中，給予細胞機械刺激（利用玻璃微電極按壓某個細胞），能夠引起一個快速、局部增強的dF/F0信號，反映了ATP的釋放。為了誘導細胞腫脹，研究者將細胞浸泡在低滲溶液（130 mOsm/kg）中;在1min內，dF/F0信號顯著增加。并且在應用MRS-2500后，這兩種刺激引起的反應都被完全抑制。研究者還發現，低滲刺激誘導的ATP釋放可能不需要依賴經典的SNARE囊泡釋放機制，因為細胞表達了破傷風毒素輕鏈（tetanus toxin light chain, TeNT，可以切割突觸短肽并阻止胞外分泌過程），但是對低滲刺激誘導的反應沒有影響；而作為對照，表達TeNT阻斷了低滲刺激誘發的谷氨酸釋放。除了刺激誘發的ATP釋放外，研究者還觀察到，即使在沒有外部刺激的情況下，神經-膠質共培養細胞中也存在自發、局部、以及短暫的ATP1.0信號。在1.6mm2成像視野中，這些自發事件以1.2次/min的速率出現，其dF/F0的平均峰值約為210%。ATP自發釋放的平均上升時間約為11s，衰減時間約為43s，其釋放范圍的平均直徑約為32mm。為了確保ATP1.0信號反映了細胞外的ATP動態變化，研究者利用三磷酸腺苷雙磷酸酶（ATP的水解酶）對細胞進行處理并成像，觀察到三磷酸腺苷雙磷酸酶能夠顯著阻斷自發事件的發生。與以前的檢測手段相比，ATP1.0具備更高的靈敏度，能夠在普通條件下特異性的檢測ATP的釋放。3. ATP1.0可用于監測斑馬魚幼體中ATP的動態變化在證明了ATP1.0可用于體外ATP的檢測后，研究者接著探討了它是否可以用于監測體內（如斑馬魚中）ATP的動態變化。在斑馬魚幼體神經元中特異性地表達ATP1.0后，利用ATP局部處理會引起視頂蓋中dF/ F0信號出現強烈的瞬時增加，這些信號能夠被MRS-2500阻斷。在驗證了ATP1.0能夠對外源ATP做出反應后，研究者進一步探討了ATP1.0是否能夠用于檢測活斑馬魚內源性ATP的釋放。ATP信號在促進小膠質細胞向損傷部位遷移中發揮關鍵作用。在表達ATP1.0的斑馬魚中，研究者發現激光消融誘導視頂蓋損傷后會導致熒光增強，其反應從損傷部位向外呈放射狀傳播。損傷后11s和64s釋放ATP的范圍，其平均直徑分別為~23mm和~34mm。接下來，研究者通過在斑馬魚的視頂葉中表達ATP1.0，同時監測ATP的釋放和小膠質細胞的遷移，斑馬魚的小膠質細胞用紅色熒光蛋白DsRed標記。研究者們發現，在激光消融后，小膠質細胞沿著ATP傳播路徑逐漸遷移到損傷部位。因此，ATP1.0非常適用于活體斑馬魚幼蟲ATP監測，并且具有較高的時空分辨率。4. ATP1.0可用于監測小鼠全身炎癥引起的ATP局部釋放ATP是應對機體急慢性炎癥反應的關鍵細胞外信使，但是在全身炎癥期間ATP釋放的模式還不清楚。研究者在小鼠腹腔注射細菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）誘導全身炎癥，并通過雙光子顯微鏡來觀察直接觀察視覺皮層ATP1.0的熒光反應。注射LPS 24小時后，研究者觀察到皮質內多次ATP局部釋放事件，在記錄的20min內，其發生頻率約為5 – 10次/min。在星形膠質細胞中，ATP釋放的上升時間相對較快（
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- 2022-05-19 15:21:24線栓法構建的局灶性腦缺血模型，你會么？
- 為什么要構建局灶性腦缺血模型？世衛組織《2020全 球衛生估計》統計顯示，2019年10大死亡原因中有7個是非傳染性疾病。其中，中風是第二大死亡原因，占總死亡人數的11%。中風，又稱“腦卒中”、“腦血管意外”，是一種急性腦血管疾病，包括缺血性和出血性卒中，其中缺血性腦血管病占60-70%。缺血性腦血管病嚴重危害人類的健康，建立一種與人腦梗塞類似的動物模型使之適合溶栓治療研究具有重要的研究意義和實用價值。卒中又名大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO），是一種局灶性腦缺血模型，也是目前應用最廣泛的腦缺血模型。其發病機理與人類缺血性腦卒中表現相似，對于制作模擬人腦缺血模型對腦缺血發病機制及藥物篩選有重要意義。如何構建局灶性腦缺血模型？構建局灶性腦缺血模型方式有很多種，栓塞法、線栓法及光化學方法等。小沃今天就教你如何運用 線栓法 建立一個完美的局灶性腦缺血模型。認識線栓法Koizumi于日本卒中會議(1985)首次報道了可逆性MCAO模型，解決了大鼠局灶腦缺血再灌流損傷研究的難題。分離暴露頸部血管，從ECA或CCA分叉處插入4～0尼龍線，進入ICA，阻斷MCA起始端及其所有側支血液供應，導致MCA區局灶缺血。一定時間后輕輕提拉插線，有阻力時提示絲線頭端已達ECA或CCA切口處，制做成再灌流模型，不需再次切開頸部。線栓法分類目前該模型具有代表性的方法有兩類，即Longa法川和Koizumi法。前者是把尼龍線頭端燒成球形，后者在尼龍線遠端徐一層硅酮彈性體（長度5 mm，直徑0.25 mm），便于插入ICA并脹緊血管。Laing對上述兩種方法做了對比研究，發現兩者腦缺血中心區細胞壞死和腦血流改變相差顯著，Koizumi法閉塞效果更好。線栓法優點線栓法的優點在于模型制作不用開顱，MCAO效果也比較理想，是目前普遍使用的能觀察再灌流損傷的局灶性腦缺血模型。線栓法實操詳細解說用線栓法建立局灶性腦缺血模型的每一個流程，長按圖片還可直接保存流程圖。圖文演示，讓你的動物實驗不再困難。
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- 2022-06-21 17:34:18“沃”的實驗 | 免費直播！腦缺血模型構建及檢測，助你快速掌握要領！
- 實驗動物該怎么選擇？不同腦缺血模型，弄不清對應構建方法？常用的血流監測技術，你都掌握了嗎？「全線賦能·“沃”的實驗」之實驗方法實戰教程直播第五期為大家聚焦《腦缺血模型構建及檢測》從實驗動物的選擇、不同模型的分類各個模型的構建方法到血流監測技術兩位老師將進行綜合詳細的講解全面助力你的科研實驗研究直播時間6月21日（周二）19：00報名方式識別上方二維碼，立即免費報名主題：腦缺血模型構建腦缺血研究背景腦缺血動物模型構建腦缺血模型構建實驗儀器講師：孫紹強瑞沃德行業解決方案專家，在膜片鉗/鈣成像/干細胞誘導方面有著豐富的實驗經驗，曾參與多項重大研發及自然科學基金項目，曾在Cell Stem Cell 上發表論文，專注于神經疾病，腦缺血及神經退行性疾病模型制備和機制研究，已為上百家客戶提供專業的神經疾病整體解決方案。主題：腦卒中研究中的血流監測技術激光多普勒激光散斑超聲多普勒核磁共振成像雙光子顯微鏡講師：殷維君瑞沃德微循環監測解決方案專家，在生理信號監測和血流血氧成像領域擁有豐富的經驗，主導動物活體成像解決方案的設計及優化，專注于臨床及臨床前微循環監測解決方案的構建。上期直播間互動問題這次我們全部為小伙伴解答Q1：組織剪切的大小有沒有具體要求，腫瘤組織一般2-4mm可以嗎？A1：這要根據組織類型去判斷，一般會預處理成10mm左右的組織塊，太大可能會導致處理不完全，太小可能導致細胞死亡增加，甚至導致樣本變稠等。Q2：細胞活率80%就可以了嗎，看到一些資料寫的都要90%以上。A2：這個需要根據下游實驗的需求靈活調整，如果樣本存活率不能達到要求的話，除了優化實驗條件以外，還可以通過一些死細胞去除的試劑來優化已獲得的樣本。Q3：低溫解離細胞與常規的37度制備單細胞優勢分別是什么？區別是什么？A3：37℃條件下進行組織解離，由于細胞轉錄活躍，因此解離過程中基因表達可能會發生改變，可能會干擾應激反應相關基因表達，所以在進行snRNA-seq時可以通過使用冷活性酶釋放細胞核，同時一些熱敏感或者脆弱的細胞更適合采用低溫解離的分離方式，但是低溫條件對一些質密難解離的組織的處理效率可能會降低。另外，溫度對不同細胞種類也有一定影響，比如在進行腦組織解離時，熱解離可能會影響神經元和星形膠質細胞的獲取，但是會大量富集小膠質細胞，所以在進行組織解離時，根據獲得目的細胞的需求要靈活調整解離方案。Q4：裂紅處理有什么注意事項嗎？A4：如果直徑6-8μm的細胞占比較高，且有核率偏低，這表明紅細胞含量可能較多，需要進行紅細胞裂解，如果紅細胞裂解依然不干凈，不建議增大裂解體系，建議適當延長裂紅時間，或適當增加裂紅次數。Q5：流式染色時間及溫度如何選擇？A5：染色本身取決于抗體抗原之間的結合能力，染色時間和溫度，受限于抗體濃度，一般根據選擇抗體的說明書推薦的濃度和孵育時間、溫度選擇。我的實踐經驗：當不清楚說明書的情況，我會選擇室溫染色12-15min（取決于抗體濃度微調），或4度冰上30min。注意染色時間盡量不要讓細胞破損，否則死細胞碎片會影響流式結果。此外細胞消化完畢后應該盡快染色處理，特別是一些凋亡染色、胞內酶染色為保持細胞物質活性，應盡快染色。Q6：請問流式細胞實驗中單抗進行熒光需要什么樣的對照？A6：關于對照設置，這個比較復雜，一般我們是選擇同型對照作為陰性對照組，得到的結果往往是比較好的。所謂的同型對照就是同種屬同亞型、相同熒光標記物、使用劑量和濃度相同，且屬于非特異性結合的抗體為同型對照組。通常用來消除抗體與抗原的非特異性結合造成的背景染色。 還有一類就是最常見的純陰性對照，檢測細胞群不進行任何抗體處理，直接進行流式檢測，這就是簡單消除細胞和溶劑本身的影響，這種方法的好處是節約抗體，畢竟抗體很貴。Q7：如何減少補償的干擾？A7：補償干擾往往是多激光的流式儀器才會發生一定干擾情況，此時，可以根據抗體公司提供的染料搭配方案選擇比較好，也就是發射光譜的波長峰盡量不重疊的染料，這樣補償干擾會盡量消除。因此，往往需要查看染料的波長范圍，此外，對于4色以上的多色標記情況，一般不常見，此時往往染料的波長范圍難以避免的重疊，這時候，推薦使用抗體公司推薦的配色方案，盡量避免發射光譜的重疊。此外很多流式儀器配套軟件都帶一定算法對補償進行修正，可以適當修正這個影響。Q8：細胞自發熒光如何解決？A8：細胞自發熒光往往是細胞內物質帶有熒光，植物細胞因為葉綠素原因會自帶一定熒光，然后一些藥物處理下，藥物本身帶有發色基團，也可能自熒光，此時，純陰性對照的設置可以補償一定的情況。然后就是染料的選擇情況，染料熒光波長范圍避免與細胞自發熒光的波長的重疊，這樣會比較好一些。我之前做藥物的細胞凋亡實驗時候，考慮到藥物的情況，就沒有使用常見的凋亡檢測的Annexin V染料，而改用Annexin V-APC 。盡量設置純陰性對照、有條件做下同型對照，往往可以在數據處理時候適當減少部分因素的影響。這樣流式的結果會更好。如果您錯過前四期直播課或想再回顧一遍戳這里→即可查看前四期直播回放↓↓本期直播記得預約噢，全程免費還可進群輕松獲取后續科研直播課信息以及更多豐富學術干貨~
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