植物表型組學研究技術

——PlantScreen表型成像技術

一、 什么是表型組？什么是表型組學？

自 20 世紀 90 年代初以來，生命科學領域出現(xiàn)了為引人注目的“組學”新概念和新學科，如基因組學（genomics）、轉錄組學（transcriptomics）、蛋白質組學（proteomics）和代謝組學（metabolomics）等。伴隨各種組學的不斷興起和發(fā)展，90年代末，人們提出了表型組（phenome）和表型組學（phenomics）的概念（圖1）。

很多科學家都試圖為表型組和表型組學下一個為精確的定義。其中較為容易理解的表型組定義為：在細胞、組織、器官、生物體或種屬水平上表現(xiàn)出的所有表型的組合。表型組學可定義為一門在基因組水平上系統(tǒng)研究某一生物或細胞在各種不同環(huán)境條件下所有表型的學科[2]。

由此，我們可以知道，和其他生物學中的組學類似，表型組學是與基因組學對應，研究基因組經過轉錄組、蛋白組、代謝組而ZZ表現(xiàn)出來的各種表型的變化（圖2）。

圖2. 基因型與表型的關系[3]

在之前很長時間的研究中，國際上尤其是中國的科學家只關注基因組學。但僅僅研究基因組學肯定是不夠的。因為基因只有表達以后才能發(fā)揮其功能和作用。如果沒有對一個基因組所對應的表型組進行研究，那么這個基因組的功能就只能說是一種推測、假說甚是臆測。因為沒有經過精確的表型組實驗，一個特定的基因組如何發(fā)揮作用是完全不清楚的，也不能知道這個基因組能夠產生什么特殊的表型或者對不同環(huán)境條件有怎樣的適應能力。這也是為什么從上世紀90年代末提出表型組和表型組學概念后，對它們的研究在國際上就逐漸變得炙手可熱的原因（圖3）。

因此，2013年Monya Baker在《Nature》發(fā)表文章“THE ‘OMES PUZZLE”將表型組學稱為“前景光明（Aspiring）”的組學研究項目（圖4）。

圖4. 目前的各種組學項目，表型組(phenome)被認為是“前景極為光明的”[4]

二、 表型組學研究技術的發(fā)展

對于生物學家來說，表型從來都不是一個陌生的概念。從生物學尤其是植物學研究之初，科學家們就在不停地測量和描述植物的各種表型。但是從現(xiàn)代科學研究的角度來說，這種對于植物表型的研究一直處于較為簡單和粗放的階段。主要通過肉眼觀察和簡單測量獲得一些對植物外部物理性狀的描述，如株高、葉片數、開花數、分蘗數、葉面積、葉長等。多也就是通過簡單公式進行一定的量化，如葉面積指數、植物緊實度等。同時，因為人力、資金、環(huán)境條件等原因，一般只能在植物生長期的幾個階段進行有限的幾次測量，根本不能跟蹤整個生活史的詳細變化情況。

這種“經典”的主要局限于對植物外部物理性的描述、基本未涉及內部及生化的特征和性狀的植物表型研究，對于現(xiàn)代表型組學研究是遠遠不夠的（圖5）。

現(xiàn)代植物表型組學研究希望在全基因組測序的基礎上，對特定基因型海量表型參數進行高通量定量研究。而且這些表型參數并不單單是形態(tài)數據，還要包含了大量深層機理數據，使科學家能夠進一步通過對表型和基因型的對照研究鑒定并預測可遺傳的性狀。

為達到這一目的，需要的研究技術有：

w 植物彩色成像分析技術——形態(tài)學表型數據

w 植物葉綠素熒光成像分析技術——光合系統(tǒng)運作機理表型數據

w 植物高光譜成像分析技術——色素組成、生化成分、氮素含量、水分含量等表型數據

w 植物熱成像分析技術——表面溫度分布、氣孔導度與蒸騰等等表型數據

w 智能光照培養(yǎng)、澆灌與稱重技術——提供植物生長的環(huán)境并研究不同環(huán)境條件對植物表型的影響

w 自動化傳送和控制技術——綜合控制各個部件，對培養(yǎng)植物進行傳送，實現(xiàn)自動測量與整個生活史的連續(xù)培養(yǎng)

現(xiàn)代技術的發(fā)展已經為科學家達到這一目標提供了支持。但是現(xiàn)在的挑戰(zhàn)是：1.如何將這些技術整合起來，建立用于不同植物物種的表型平臺；2.縮小實驗室與野外研究的差距[6]。

三、PlantScreen植物表型成像分析技術

PSI公司在2012年以FluorCam葉綠素熒光成像技術為核心，結合LED植物智能培養(yǎng)、自動化控制系統(tǒng)、植物熱成像分析、植物近紅外成像分析、植物高光譜分析、自動條碼識別管理、RGB 真彩 3D 成像、自動稱重與澆灌系統(tǒng)等多項先進植物表型技術，開發(fā)出了PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)（圖6）。

LED植物智能培養(yǎng)	自動化植物傳送	RGB真彩3D成像	自動稱重與澆灌系統(tǒng)
葉綠素熒光成像測量分析	植物熱成像分析	植物近紅外成像分析	植物高光譜分析

圖6. PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)及其各個功能模塊

這一大型系統(tǒng)切合國際ZX的植物表型組學研究，以ZY化的方式實現(xiàn)了擬南芥、小麥、水稻、玉米乃各種其它植物的全方位生理生態(tài)與形態(tài)結構高通量自動成像分析。用于高通量植物表型成像分析測量、植物脅迫響應成像分析測量、植物生長分析測量、生態(tài)毒理學研究、性狀識別及植物生理生態(tài)分析研究等。

1. PSI公司的技術優(yōu)勢

圖7. 歐洲自動化花卉生產工廠

由于表型組學研究的興起，現(xiàn)在有很多公司與科研機構都在開發(fā)用于表型組學研究的儀器系統(tǒng)。但如果仔細探究這些公司的發(fā)展過程，好像他們在成立之初就能開發(fā)這么全面、高端的儀器系統(tǒng)。實際上這得益于歐美成熟的植物自動化培養(yǎng)技術。這一技術在歐美廣泛應用于花卉、蔬菜等的生產（圖7）。這些公司大多是以植物自動化培養(yǎng)技術為基礎，再從別的廠家采購一些光源、相機組裝成所謂的表型研究儀器。這些廠家不但沒有真正的植物表型科研背景；各個成像模塊很多也是工業(yè)上使用的，并沒有大量科學文獻的支持，ZZ的數據精度根本無法滿足真正表型研究的需要；甚很多數據結果都沒有專用植物表型分析軟件，而只有簡單的圖像獲取功能。

而PSI公司則與這些廠家完全不同。

PSI公司是捷克科學院Nedbal教授與現(xiàn)任PSI公司總裁、布爾諾（孟德爾發(fā)現(xiàn)遺傳定律的城市）植物表型研究中心主任Trtilek博士共同成立的，是真正DJ植物科學家建立的公司，本身就承接大量歐盟的科研項目并與捷克科學院聯(lián)合成立了捷克變化中心（圖8）。

圖8. PSI公司總部及PSI植物表型研究中心，公司大門可見捷克變化中心和歐盟科研項目標志

2015年是“遺傳學之父”孟德爾在捷克布爾諾發(fā)表其的豌豆雜交實驗《植物雜交試驗》論文150周年，PSI公司與歐洲工程技術中心（CEITEC）、捷克科學院CzechGlobe變化研究中心、Masarykova大學及孟德爾博物館共同舉辦了“國際植物與藻類表型組學會議”（International Plant and Algal Phenomics Meeting IPAP 2015，圖9），數十名歐美、亞洲的DJ植物科學家參加了本次會議。2016年9月還將舉辦IPAP 2016，詳情請點擊鏈接：IPAP2016。有興趣參加本次會議的老師可與易科泰生態(tài)實驗室聯(lián)系：王慧娟 info@eco-lab.cn；李川 eco-lab@eco-tech.com.cn

圖9. IPAP2015會議現(xiàn)場

圖10. 應用于不同樣品的各種FluorCam葉綠素熒光成像系統(tǒng)

PSI公司一直致力于開發(fā)各種植物表型相關研究技術，包括葉綠素熒光技術、植物光譜技術、LED智能培養(yǎng)技術及各種藻類研究技術等。其開發(fā)的FluorCam葉綠素熒光成像技術已成為世界上權威、使用廣、種類全面、發(fā)表論文多的葉綠素熒光成像技術（圖10）。無論是葉綠素熒光權威書籍《Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis》（Nedbal也是本書的合作作者之一），還是引用次數高達1200的葉綠素熒光研究綜述《Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In Vivo》都將FluorCam調制式葉綠素熒光成像技術的出現(xiàn)作為葉綠素熒光研究進入二維時代的里程碑[7, 8]。關于FluorCam葉綠素熒光成像技術的更多信息請查閱：如何選配適用的葉綠素熒光成像儀器。

圖11. 德國尤里希研究中心（Forschungszentrum Jülich GmbH）使用PSI公司SL3500 LED光源開發(fā)的植物生長室[9]

而他們生產的各種LED光源被很多其他歐洲公司和科研機構直接用于集成生產各種植物生長箱和大型生長室（圖11）。PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)是將這些高精尖的科研儀器再輔以自動化控制部件集成的ZX儀器系統(tǒng)，并且制作了專用植物表型分析科學軟件，每一個成像模塊都可以在獲得幾十項表型相關參數和相應的成像圖，保證了數據的精確性和可信度。PlantScreen是真正的科研級表型組學研究系統(tǒng)，受到國際科研機構和大型跨國種業(yè)公司的一致認可（圖12）。

同時，PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)由廠家專業(yè)工程師上門安裝。系統(tǒng)配備專用的網絡通訊軟件，后續(xù)使用中可通過網絡由廠家遠程操作實現(xiàn)軟件更新和實時故障診斷，對客戶網絡沒有獨立IP等特殊要求。這一通訊軟件可以由用戶自行決定開啟和關閉并設置密碼，不必擔心數據通過網絡外泄。

圖12. 國內外裝備PlantScreen的部分科研單位及跨國種業(yè)和農藥公司

2. PlantScreen如何解決表型組學研究中的兩個挑戰(zhàn)

之前提到在表型組學研究中有兩個挑戰(zhàn)：1.如何將這些技術整合起來，建立用于不同植物物種的表型平臺；2.縮小實驗室與野外研究的差距。

對于DY個問題，PSI公司憑借自己的技術，根據客戶具體需求，對每一套系統(tǒng)都進行了特別定制，從而實現(xiàn)了對擬南芥、小麥、水稻、玉米乃各種其它植物的精確表型組學研究（圖13）。而一般的商用儀器，型號設計一旦定型就不能再做修改，往往不能適用于科學家的具體實驗要求。

圖13. 左：用于玉米、水稻、蔬菜的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)；右：捷克Palacky大學定制的用于擬南芥和豌豆的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)[10]

而縮小實驗室與野外研究差距的方法，就是直接在野外大田中開展表型組學研究。為此，PSI公司開發(fā)了野外樣帶版的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)，ZD限度實現(xiàn)了野外的表型組學成像自動分析（圖14）。同時，PSI正在開發(fā)可搭載到無人機上的小型表型成像分析平臺。

圖14. PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)野外樣帶版

四、 PlantScreen植物表型成像分析技術應用案例

1. 葉綠素熒光成像分析

葉綠素熒光成像可以動態(tài)反映植物連續(xù)生長過程中光合系統(tǒng)光合能力的變化。圖15中為鹽脅迫處理的擬南芥。對照組與處理組的量子產額ΦPSII從處理后就開始產生差異，這反映了鹽分對光系統(tǒng)II光下電子傳遞效率的影響。而從左側的成像圖中，我們可以通過顏色就直觀地分辨出兩者之間的差異。

圖15. 鹽脅迫下擬南芥的脅迫響應研究

這種連續(xù)高通量熒光監(jiān)測，在一些快速脅迫表型分析中會更為有效。在給菜豆施加除草劑敵草隆后，我們可清晰地看到隨著敵草隆被葉片吸收擴散，首先是主葉脈基部的光合系統(tǒng)受到損傷，之后損傷逐漸擴展到主葉脈中部、次葉脈和葉肉（圖16）。

圖16. 敵草隆對菜豆葉片光合能力的損傷[11]

2. RGB 彩色 3D 成像分析

彩色成像主要用來分析植物的各種形態(tài)學參數。圖17為干旱脅迫處理后擬南芥每天的形態(tài)學分析圖。我們可以明顯看到9-10天時，處理組的生長受到了極大的影響，葉片開始枯萎。

圖17. 干旱脅迫處理擬南芥的形態(tài)學分析圖

而通過專業(yè)軟件進行深入分析后，我們可以得到擬南芥的生長動態(tài)變化曲線、葉面積、植物緊密度、周長、葉片細長度（SOL）等二十余項形態(tài)學參數，將植物生長過程中的各種形態(tài)變化通過一系列量化的指標體現(xiàn)出來（圖18）。

圖18. 干旱脅迫處理擬南芥的各種形態(tài)學參數

同時，彩色成像可以進行不同方向的形態(tài)學分析，甚擬合3D形態(tài)學模型。帕拉茨基大學的Jan Humplík利用PlantScreen系統(tǒng)研究了兩種不同品種豌豆（Terno和Enduro）在低溫脅迫的表型變化[12]。他們使用RGB成像測量了7個時間點的總綠色面積、歸一化綠色面積和生長速率的變化（圖19），發(fā)現(xiàn)TER的生長速度要顯著高于END。到第21天，TER的總綠色面積增加了3.5倍，而END只增長了2.5倍。

圖19.TER植株在21天低溫適應中的正面RGB成像圖[12]

圖20. 鹽處理小麥幼苗的熱成像圖[1]

3. 熱成像分析

PlantScreen的熱成像模塊主要用于獲得植物表面溫度分布的熱成像圖。用于各種植物溫度變化的研究，如干旱、高溫、滲透壓、熱干風、病害等生物和非生物脅迫以及某些特殊發(fā)育階段造成的植物表面溫度分布變化，進而可以反映植物葉片蒸騰情況和氣孔導度的差異變化（圖20）。

通過在培養(yǎng)液中添加甘露醇模擬滲透壓脅迫，處理后的擬南芥因為無法進行正常的蒸騰作用，葉片溫度快速升高。生長過程中，對照組的溫度一直保持在22-23℃，而處理組的溫度竟然比對照組高了將近2℃（圖21）。

圖21. 滲透壓脅迫處理擬南芥的熱成像圖

4. 高光譜成像分析

PlantScreen的高光譜成像模塊主要用于測量植物的反射光譜成像圖，在測量的波段范圍內可獲得幾十到上百張不同波段的光譜成像圖。這些成像圖用來計算如下植被指數：

1) 歸一化差值植被指數（Normalized Difference Vegetation Index (NDVI)）

2) 簡單比值指數（Simple Ratio Index, Equation: SR = RNIR / RRED）

3) 改進的葉綠素吸收反射指數（Modified Chlorophyll Absorption in Reflectance Index (MCARI1), Equation: MCARI1 = 1.2 * [2.5 * (R790- R670) - 1.3 * (R790- R550)]）

4) ZY化土壤調整植被指數（Optimized Soil-Adjusted Vegetation Index (OSAVI), Equation: OSAVI = (1 + 0.16) * (R790- R670) / (R790- R670 + 0.16)）