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1、均一性與穩(wěn)定性控制

佐劑（Adjuvant）又稱免疫調(diào)節(jié)劑或免疫增強(qiáng)劑（Immunepotentiator），是作為疫苗的一種添加劑，當(dāng)它先于抗原或與抗原混合注入機(jī)體后，能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或者改變免疫反應(yīng)的類型，屬于非特異性的免疫增強(qiáng)劑，而其本身無(wú)抗原性。理想的佐劑不僅能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)，而且能使機(jī)體獲得Z 佳的保護(hù)性免疫。乳佐的均一性和穩(wěn)定性是非常重要的兩個(gè)考察項(xiàng)，而與此直接相關(guān)的是粒度的控制1。

Z 近發(fā)布在Nature的文章表明，對(duì)MF59而言，平均粒徑在160nm（MF59）左右效果比較佳2，粒徑過(guò)大及過(guò)小效果都欠佳。此外，小顆粒濃度（如＜100nm）及大顆粒濃度（如＞1.2μm）過(guò)高均影響Z 后的藥效且?guī)?lái)副作用危害。因此，除對(duì)平均粒徑控制外，“過(guò)大”，“過(guò)小”顆粒濃度控制也非常重要。值得注意的是，在實(shí)際應(yīng)用中，產(chǎn)品穩(wěn)定性指標(biāo)是一個(gè)非常重要的考察項(xiàng)，用于快速篩選配方及優(yōu)化工藝。

奧法美嘉平臺(tái)提供整套的乳佐制備及粒度表征控制整套解決方案，可用于快速評(píng)估、優(yōu)化乳佐配方和工藝：PSI高壓微射流均質(zhì)機(jī)用于制備、Nicomp粒度分析儀分析平均粒徑、AccuSizer顆粒計(jì)數(shù)器分析大粒子濃度，LumiSpoc 顆粒計(jì)數(shù)器分析小粒子濃度、Lum 穩(wěn)定性分析儀快速分析乳佐穩(wěn)定性，Entegris-ANOW 濾芯過(guò)濾雜質(zhì)及大顆粒。

2、乳佐流程概述

乳佐的常規(guī)制備方法為：制備水相、油相，經(jīng)過(guò)混合、剪切步驟形成初乳，初乳經(jīng)微射流均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，而后除 菌過(guò)濾得到乳佐。初乳、均質(zhì)后乳液、除 菌過(guò)濾后乳液通過(guò)PSS的Nicomp粒度分析儀測(cè)試平均粒徑、AccuSizer顆粒計(jì)數(shù)器測(cè)試過(guò)大顆粒濃度、Lum穩(wěn)定性分析儀快速篩選乳佐配方穩(wěn)定性。另通過(guò)Lumispoc檢測(cè)過(guò)小顆粒濃度。

圖1 乳佐解決方案圖示

3、乳佐粒度控制

以MF59為例，國(guó)際廠家在其專 利乳佐制備上，對(duì)粒徑進(jìn)行嚴(yán)格控制，控制初乳、微射流均質(zhì)后乳液、除 菌過(guò)濾后乳液的平均粒徑及大于1.2μm的油滴濃度2,3。

高壓微射流均質(zhì)機(jī)

PSI-20高壓微射流均質(zhì)機(jī)（小試兼中試型）采用固定結(jié)構(gòu)的均質(zhì)腔，通過(guò)電液傳動(dòng)的增壓器使物料在高壓作用下以極大的速度流經(jīng)交互容腔的微管通道，物料流在此過(guò)程中受到高剪切力、高碰撞力、空穴效應(yīng)等物理作用，使得平均粒徑降低、體系均一穩(wěn)定，由此獲得理想的均質(zhì)、分散或乳化結(jié)果。

圖2 高壓微射流均質(zhì)機(jī)

Z 高2069 bar的均質(zhì)壓力，Z 高處理量20L/h （PSI-20）

采用特殊設(shè)計(jì)Y型腔，去除尾端大顆粒效果佳，物料的混合更均一，處理效率高。

屏顯界面，數(shù)據(jù)可溯源：支持?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)出設(shè)定壓力及實(shí)時(shí)壓力、監(jiān)測(cè)點(diǎn)溫度、實(shí)時(shí)流量、時(shí)間等。

配置K型熱電偶：可用于實(shí)施監(jiān)測(cè)料液溫度。

低噪音：運(yùn)行音量低于70分貝，工作環(huán)境友好型。

4、平均粒徑檢測(cè)

乳佐的粒度對(duì)其免疫效果起到很大的作用，整體平均粒徑過(guò)大過(guò)小都不利于乳佐的免疫效果，以MF59為例，一般平均粒徑在160nm 左右效果比較佳。其平均粒徑不宜過(guò)大，相比于微米級(jí)別的液滴，納米級(jí)別的乳佐更易于無(wú)菌過(guò)濾，耐受性良好，比更大的微米級(jí)W/O乳液佐劑具有更好的免疫原性和穩(wěn)定性。但平均粒徑過(guò)小，則會(huì)降低其在肌肉中的停留時(shí)間，導(dǎo)致從注射部位排除更快地排除，從而降低了藥物效果，因?yàn)檩^小的顆粒比較大的顆粒更容易通過(guò)細(xì)胞內(nèi)間隙外滲，并更快地到達(dá)淋巴結(jié)。因此，平均粒徑需在合適范圍內(nèi)。

Nicomp納米激光粒度儀系列

Nicomp系列納米激光粒度儀采用動(dòng)態(tài)光散射原理檢測(cè)分析樣品的粒度分布，基于多普勒電泳光散射原理檢測(cè)ZETA電位。

圖3  Nicomp 3000系列

粒徑檢測(cè)范圍0.3nm-10μm，ZETA電位檢測(cè)范圍為+/-500mV

搭載Nicomp多峰算法，可以實(shí)時(shí)切換成多峰分布觀察各部分的粒徑。

高分辨率的納米檢測(cè)，Nicomp納米激光粒度儀對(duì)于小于10nm的粒子仍然現(xiàn)實(shí)較好的分辨率和準(zhǔn)確度。

圖4  高斯粒徑分布圖

圖5  多峰粒徑分布圖

5、小粒子和尾端大粒子濃度檢測(cè)

乳佐常規(guī)的平均粒徑一般為亞微米級(jí)別或納米級(jí)別，但是微米的乳粒往往大量存在，這些尾端大粒子的存在往往會(huì)吸附小顆粒，影響乳佐的穩(wěn)定性，分析尾端大粒子濃度和數(shù)量，可以評(píng)價(jià)當(dāng)前配方和工藝的情況并做出相應(yīng)的優(yōu)化。USP729規(guī)定乳劑中大于5μm的乳粒(PFAT5)體積占比不得超過(guò)0.05%，但目前還未有藥典對(duì)乳劑中的下限進(jìn)行規(guī)定，這并不意味著小粒子無(wú)需關(guān)注。如果過(guò)小顆粒濃度過(guò)多，如低于100nm，幾十納米左右，那么注入體內(nèi)后可以穿過(guò)人體內(nèi)大部分細(xì)胞屏障，到達(dá)的人體部位更多更廣，由此造成的毒副作用會(huì)增加。

AccuSizer顆粒計(jì)數(shù)器系列

AccuSizer系列在檢測(cè)液體中顆粒數(shù)量的同時(shí)精確檢測(cè)顆粒的粒度及粒度分布，通過(guò)搭配不同傳感器、進(jìn)樣器，適配不同的樣本的測(cè)試需求，能快速而準(zhǔn)確地測(cè)量顆粒粒徑以及顆粒數(shù)量/濃度。

圖6 AccuSizer A7000系列

0.01μm的超高分辨率，AccuSizer系列具有1024個(gè)數(shù)據(jù)通道，能反映復(fù)雜樣品的細(xì)微差異，為研發(fā)及品控保駕護(hù)航。靈敏度高達(dá)10PPT級(jí)別，即使只有微量的顆粒通過(guò)傳感器，也可以精 準(zhǔn)檢測(cè)出來(lái)。檢測(cè)范圍為0.5μm-400μm（可將下限拓展至0.15μm）。

LumiSpoc單粒子顆粒計(jì)數(shù)器

LumiSpoc采用單粒子光散射技術(shù)（SPLS），通過(guò)在光學(xué)流通池中進(jìn)行流體動(dòng)力聚焦，將單個(gè)粒子排列成一條直線。通過(guò)調(diào)整流動(dòng)條件來(lái)調(diào)整樣品濃度，從而避免濃度峰值的影響。當(dāng)單個(gè)納米或者微米顆粒經(jīng)過(guò)特殊光束截面的激光束時(shí)，記錄其正向和側(cè)向散射的光強(qiáng)。根據(jù)米氏理論，將分類強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為粒度分布密度。通過(guò)軟件分析顯示計(jì)數(shù)分布、顆粒濃度。在行業(yè)內(nèi)已有使用Lumispoc用于顆粒濃度的監(jiān)測(cè)成功案例

圖7 LumiSpoc 單粒子顆粒計(jì)數(shù)器

快速、直接測(cè)試穩(wěn)定性，無(wú)需稀釋，溫度范圍寬廣

可同時(shí)測(cè)8個(gè)樣品，測(cè)量及辨別不同的不穩(wěn)定現(xiàn)象及不穩(wěn)定性指數(shù)

加速離心，Z 高等效2300倍重力加速度

6、穩(wěn)定性分析檢測(cè)

穩(wěn)定性是評(píng)估藥物的常規(guī)項(xiàng)，乳佐穩(wěn)定性影響存放時(shí)間和有效期，穩(wěn)定性較差的乳佐不僅會(huì)增加運(yùn)輸儲(chǔ)存成本，還有可能增加用于人體使用的風(fēng)險(xiǎn)。在乳佐制備中，控制尾端大粒子數(shù)量和濃度能使乳佐更為穩(wěn)定，國(guó)外某知名公司的專 利中重 點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了＞1.2μm的液滴濃度[3]，因?yàn)檫@部分液滴濃度過(guò)高，會(huì)凝聚或者聚結(jié)，從而導(dǎo)致乳液不穩(wěn)定。

LUM穩(wěn)定性分析儀

LumiFuge穩(wěn)定性分析儀可以直接測(cè)量整個(gè)樣品的分散體的穩(wěn)定性，檢測(cè)和區(qū)分各種不穩(wěn)定現(xiàn)象，如上浮、絮凝、聚集、聚結(jié)、沉降等，通過(guò)測(cè)量結(jié)果可用來(lái)開(kāi)發(fā)新的配方和優(yōu)化現(xiàn)有的配方及工藝。

圖8 LUM穩(wěn)定性分析儀

快速、直接測(cè)試穩(wěn)定性，無(wú)需稀釋，溫度范圍寬廣。

可同時(shí)測(cè)8個(gè)樣品，測(cè)量及辨別不同的不穩(wěn)定現(xiàn)象及不穩(wěn)定性指數(shù)。

加速離心，Z 高等效2300倍重力加速度。

7、過(guò)濾

微射流處理后的乳液經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臑V芯過(guò)濾工藝。過(guò)濾可去除前置工藝流程中的大油滴，這部分油滴雖然數(shù)目很少，但這些油滴體積占比較大，且極易成為聚集的成核位點(diǎn)，吸附更多的小液滴，導(dǎo)致儲(chǔ)藏過(guò)程中乳液穩(wěn)定性降低。4濾膜的材質(zhì)將影響過(guò)濾后的效果，綜合考量物理攔截，吸附攔截等效果，選擇適配的濾膜材質(zhì)用于過(guò)濾，此外，還需結(jié)合乳液配方考慮相容性穩(wěn)定。

Entegris濾芯

Entegris-Anow是一家高分子微孔膜過(guò)濾企業(yè)，專業(yè)從事MCE、Nylon、PES、PVDF、PTFE等（膜孔徑為0.03μm~10μm）微孔膜的研發(fā)及生產(chǎn)，具有二十多年服務(wù)與醫(yī)藥客戶經(jīng)驗(yàn)，并為全 球生物制藥、醫(yī)療器械、食品飲料、實(shí)驗(yàn)室分析、微電子及工業(yè)等領(lǐng)域的客戶提供過(guò)濾、分離和凈化解決方案。

Entegris與Anow的結(jié)合，引入Entegris質(zhì)量管理體系，每一支濾芯都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢查，此外，新建成的CTC驗(yàn)證中心，為全 球客戶提供專業(yè)的驗(yàn)證服務(wù)。