作為一種新的藥物形式，mRNA在多個疾病領域具有顯著的ZL潛力。進入細胞后，mRNA藥物使用內源性細胞機制來表達預編程的蛋白質。這種表達的蛋白質可以實現多種目的，從促進特定的免疫反應到調節或恢復各種代謝過程等^[1]。據WHO官網統計，全 球目前正在臨床試驗階段的mRNA藥物已有幾十種，應用方向覆蓋傳染性疾病、罕見病、腫瘤免疫學等。

與大多數生物ZL藥物一樣，序列分析也是mRNA藥物的一個關鍵質量屬性（CQA）。經典的檢測方法如Sanger測序和二代測序 (NGS)等已被用于核酸鏈高通量及大規模的測序。然而在生物制品的表征分析中，往往需要正交方法以獲取更全面的信息。對于核酸分析，LC-MS 作為Sanger和NGS的正交方法，與傳統測序技術相比具有獨特的優勢：可直接對核酸樣品進行分析（無需擴增等處理步驟）；更高的檢測靈敏度（直接檢測低水平的序列變異體或修飾雜質（<1%豐度），且只需少量樣品）；更短的分析時間；可直接檢測修飾核苷酸、自動識別修飾位點、種類和含量；避免傳統測序過程中造成的堿基錯誤匹配^[2]。

由于核酸樣品與蛋白樣品的較大差異，其測序流程的前處理及LC/MS方法也大不相同。核酸僅有4個特定堿基，在組合形式上遠小于蛋白序列，因此會有多個重復序列片段，需要酶解成較長的片段（通常大于15nt）以得到可用于序列覆蓋的特征片段。此外核酸樣品極不穩定，非常容易降解。基于此需求，我們在前處理上需要選擇特異性較強的酶，并且減少酶解時間，得到具有漏切位點的較長片段。下圖顯示了優化后的核酸mapping分析流程，從前處理到液相分離、質譜檢測、數據分析的一套完整方案。

01

# 前 處 理

Nuclease T1是一種真菌核酸內切酶，可切割鳥嘌呤殘基后的單鏈RNA，具有較強的特異性，常用于核酸測序應用。但由于核酸內切酶效率很高，酶解時間較難控制，且傳統的溶液酶解方法會使核酸酶殘留在分析柱上造成污染。基于以上需求，賽默飛推出了一款前處理磁珠RNase T1 Mag Bulk Kit，將Nuclease T1酶固定在磁珠上，通過簡單快速的磁鐵吸附及可有效控制酶解時間，并去除溶液里的T1酶，該方式可以有效提高實驗的重現性并降低酶的干擾（如下圖）。

有離線及在線兩種方式可供選擇：

a) 將樣品配成200 μL體積放于eppendorf管中（如下圖a所示），置于酶解儀中震蕩孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通過磁鐵吸附的方式將酶解上清與磁珠分離，再加入1%甲酸終止反應；

圖a:手動前處理示意圖

b) 采用全自動磁珠純化儀，反應、分離及純化均可根據設置好的程序進行自動操作，適用于高通量前處理需求（圖b）。

圖b: 全自動化在線前處理示意圖

反應條件的優化：

a. 反應時間：酶解時間控制在5min 內，隨著反應時間的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆蓋度明顯降低。對于修飾mRNA（如甲基化修飾），需要增加反應時間至30min.

b. 反應溫度：37℃與50℃的結果類似

02

# 色 譜 柱

色譜分離采用一款專用于核酸分析的色譜柱，Thermo Scientific? DNAPac? RP，該色譜柱由球形寬孔徑 4 μm 聚合樹脂構成，可耐受極端 pH (0-14) 和溫度 (5-110°C) 條件，在HPLC 和UHPLC儀器上均可使用，針對寡核苷酸可實現高分辨率和高通量，較小和極大的核酸鏈均可分辨(如下圖A)。

圖A

圖B顯示DNAPac? RP色譜柱的各類型號，mRNA mapping建議選用2.1*100 mm型號。

03

# 液 相 系 統

核酸樣品吸附性強，而生物惰性液相系統吸附低；其次離子對試劑易腐蝕液相系統管路及接口，因此建議使用生物兼容的Vanquish UHPLC系統。

液相方法如下圖：

04

# 質 譜

新一代Orbitrap Exploris系列產品具有體積小、性能高、操作簡單等優勢，擴展了Q Exactive系列質譜儀器的分析能力。如下圖a所示，內置的AcquireX數據采集工作流程，為各種不同類型的應用設置參數模板，一鍵調用，可進行全面自動化的樣品分析；且帶有EASY IC離子源內標校正，保證儀器的高質量精度；更快的掃描速度可提高樣品分析通量。圖b顯示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一級采用120，000分辨率，二級30，000分辨率；負離子掃描模式；stepped NCE 25,28,31 。該方法模板可一鍵調用，操作簡便，且得到高質量的譜圖。

05

# 數 據 分 析 軟 件

Biopharma Finder軟件可實現核酸樣品自動化數據分析，如下圖a所示，軟件支持DNA及RNA樣品序列管理，可自定義核酸骨架和可變修飾，操作簡便；對二級譜圖進行自動化注釋和解析；寡核苷酸雜質定性和相對定量分析；多批次樣品含量變化趨勢比對。

圖b 展示定結果圖表，列表里的每一行代表一條鑒定的核酸鏈，右上方對應的理論及實測二級圖譜，將圖譜里響應很低的峰放大，可以清楚的看到碎片離子的同位素峰，結果可信度高。

Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基礎上增加了長鏈mRNA mapping的功能，在數據處理方法中增加核酸酶模塊，有常見的幾種酶供選擇，也可自定義添加酶。下圖展示mapping分析結果，對于mRNA樣品中每一條確證序列的片段，均可溯源詳細信息，如在序列中的位置、一級和二級譜圖、可信度、定量信息等。

得益于Orbitrap儀器采集的高質量圖譜，在核酸分析結果里幾乎每一條鏈都可實現100%序列覆蓋（Average Structural Resolution=1.0），這對于區分同分異構體非常有幫助。前面我們提到mRNA由4個特定堿基構成，在其酶解片段中出現同分異構是常見的現象，如下圖，當儀器檢測到足夠多的碎片離子，可以確證同分異構的兩條鏈里的每一個堿基，即可輕松區分兩條分子量相同，序列不同的片段。

對于長鏈RNA片段，如下圖具有13個漏切位點，48個堿基長度的片段，也可鑒定到每一個堿基，得到高可信度結果。酶解片段越長，其序列特異性越強，對于RNaes T1酶解無法覆蓋的短片段，也可采用mazF酶解得到的更長片段作為互補信息。

案例分享：

編碼新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)樣品分析，首先用反相離子對色譜檢測mRNA樣品純度，如下圖a所示。

采用上述mRNA mapping分析平臺，從前處理到液質表征分析，得到如下結果：圖b顯示mRNA樣品經過RNase T1酶解后的總離子流圖，由于部分酶解，得到的片段較長，具有高特異性；對于長度3900nt的mRNA樣品，在該分析流程下，僅用RNase T1酶，即可獲得98.5%序列覆蓋度結果。

圖a

圖b: Spike Protein mRNA digested with T1

圖c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA

基于Orbitrap高分辨質譜核酸分析平臺，可以實現mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、雜質鑒定及定量等功能，為疫苗開發和質控提供更精確可靠的數據。

參考文獻：

[1]Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)

[2]Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500?8506 (2019)