治 療性寡核苷酸有著獨特的基因表達調控優(yōu)勢，隨著其成藥性潛力被不斷挖掘，與其相關的研發(fā)、生產(chǎn)和商業(yè)化進程得到快速發(fā)展。與傳統(tǒng)化學藥物的研究過程類似，寡核苷酸藥物臨床前均需要進行體外和體內(nèi)的代謝行為研究，闡明藥物藥效及代謝途徑。

寡核苷酸藥物的代謝行為

寡核苷酸藥物的代謝行為與小分子藥物存在很大不同，它幾乎不經(jīng)肝微粒體酶代謝，主要通過血液和靶器官中核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶水解磷酸酯鍵形成小的核酸片段。從3’-端通過核酸外切酶水解生成主要代謝產(chǎn)物，其次是5’-端通過核酸外切酶水解產(chǎn)物及核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的代謝物。為了提高寡核苷酸藥物的穩(wěn)定性、藥效及安全性，藥物會被化學修飾，包括硫代磷酸、2’-O-甲氧基乙基核糖、N-乙?；肴樘前沸揎?。寡核苷酸藥物的藥代動力學性質與核酸磷酸主鏈及核糖的化學修飾類型密切相關。

寡核苷酸藥物代謝產(chǎn)物鑒定

目前寡核苷酸藥物代謝產(chǎn)物鑒定的主要分析方法是基于LC-HRMS開展的，通過全掃描和二級碎片信息的采集，獲得寡核苷酸及其代謝產(chǎn)物信息。沃特世高分辨質譜Xevo G3 QTof結合waters_connectINTACT Mass和CONFIRM Sequence應用程序平臺，為寡核苷酸代謝物鑒定提供有效解決方案。

寡核苷酸藥物代謝物產(chǎn)物鑒定中的分析難點

1)色譜分離

寡核苷酸藥物分子具有強極性，利用常規(guī)反相色譜分離方法較難保留，通常使用反相離子對色譜（IP-RPLC）、親水色譜（HILIC）、離子交換色譜（IEX），其中IEX和IP-RPLC的分離度優(yōu)于HILIC，但是IP-RPLC跟質譜兼容性更好。由于寡核苷酸藥物代謝物復雜，且存在與母藥性質非常接近的n-1代謝物，給分離帶來很大挑戰(zhàn)。所以目前寡核苷酸藥物代謝產(chǎn)物鑒定以IP-RPLC為常用方法，使用三乙胺（TEA）、N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）、乙酸三乙胺（TEAA）等和六氟異丙醇（HFIP）組成離子對試劑。

由于寡核苷酸藥物分子的多負電性，在色譜分離系統(tǒng)中存在非特異吸附問題，嚴重影響色譜分離度和低含量代謝物的發(fā)現(xiàn)。沃特世ACQUITY Premier系統(tǒng)采用Max Peak高性能表面技術，能夠減少金屬敏感分析物的非特異性吸附，減少分析物損失，提高分析重現(xiàn)性。針對寡核苷酸藥物色譜分離難點，Premier技術可以顯著改善寡核苷酸藥物的峰形、回收率和重現(xiàn)性，無需系統(tǒng)和色譜柱鈍化。

圖1. 全硫代磷酸化寡核苷酸反義藥物GEM91 ACQUITY Premier方案和標準方案比較。

2) 高分辨質譜分析及代謝產(chǎn)物鑒定

通過Xevo G3 QTof提供高質量分辨率、靈敏度和可靠性，全掃描和二級碎片采集MSE技術結合，全面獲得寡核苷酸及代謝產(chǎn)物的質譜信息。寡核苷酸的代謝產(chǎn)物鑒定和未知代謝物序列確認過程復雜，需要專業(yè)的軟件進行輔助識別和分析。

waters_connect INTACT Mass應用程序，可以自動進行寡核苷酸質量確認，實現(xiàn)更快的樣品分析。可定制的化合物庫，允許終端用戶輸入自定義同位素模型，支持自動化核酸確認。

waters_connect CONFIRM Sequence應用程序平臺可以自動確認治 療藥物及其代謝物的核酸序列，對未知代謝物進行序列確認。給定一個目標核酸序列，CONFIRM Sequence應用程序將自動生成一個預測碎片列表，并搜索這些碎片離子的二級質譜數(shù)據(jù)，標注所有匹配。該應用程序可以自動處理來自Xevo G3 QTof的MS/MS數(shù)據(jù)。當處理完成時，一個可視化的“點圖”將顯示寡核苷酸序列和所有已發(fā)現(xiàn)的片段以及序列覆蓋率的百分比。

圖2.核酸藥物完整分子量分析結果。

圖3. 核酸二級序列確認

案例分享

以ASO藥物Eluforsen作為研究對象開展代謝物鑒定工作，利用LC-QTof平臺實現(xiàn)Eluforsen及其代謝物的成功分離和檢測，Eluforsen及其代謝物代表性色譜圖見圖4。結合UNIFI的數(shù)據(jù)處理功能，成功鑒定Eluforsen的代謝產(chǎn)物主要以3’端和5’-端的水解產(chǎn)物為主，結果見表1。利用LC-QTof平臺也可以實現(xiàn)代謝產(chǎn)物形成速率的測定，結果見圖5。

圖4. 核酸藥物Eluforsen及其代謝物的代表性提取離子流圖。

圖5. 小鼠肝臟勻漿中Eluforsen 3’端水解產(chǎn)物的形成速率。（50 μg/mL eluforsen與肝臟勻漿孵育0, 24, 48, 72, 96, 120 h）

表1. 純化核酸酶和小鼠肝臟勻漿孵育后體外產(chǎn)生的Eluforsen代謝物以及小鼠和猴子肝臟和肺樣品中體內(nèi)產(chǎn)生的代謝物。

4) 總結

寡核苷酸藥物因特殊的結構特點具有極性大、負電性等特性，給代謝物分離和鑒定都帶來很大的挑戰(zhàn)。沃特世Premier UPLC技術可以有效解決寡核苷酸藥物非特異性吸附問題，提高IP-LC分離性能，提升低含量代謝物的檢出率。Xevo G3 QTof全掃描和二級采集MSE技術結合，提供更全面的寡核苷酸及代謝產(chǎn)物質譜信息，利用waters_connect平臺的數(shù)據(jù)處理能力實現(xiàn)寡核苷酸藥物代謝產(chǎn)物鑒定和未知物確證。沃特世持續(xù)致力于提供更滿足客戶需求的寡核苷酸藥物代謝研究的解決方案，助力客戶加速藥物研發(fā)。

參考文獻：

1. Jaeah Kim, Babak Basir, Chopie Hassan, et. al., Molecular Therapy: Nucleic Acids, 2019, 17, 714-725.

2. Ju Liu, Jing Li, Chris Tran, et. al., Bioanalysis, 2019, 11(21), 1967-1981.