前言

時(shí)間分辨熒光（Time-Resolved Fluorescence，TRF）技術(shù)近年來使用范圍日趨廣泛，其技術(shù)原理Z 早可追溯至獲得 1967 年諾貝爾化學(xué)獎的“閃光光解技術(shù)”。與傳統(tǒng)熒光檢測方法相比，TRF 有著靈敏度高、樣品制備簡單、檢測重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)[1]，因此衍生出不少基于 TRF 的新興技術(shù)。

熒光壽命是一種分子性質(zhì)，通常與熒光團(tuán)濃度、激發(fā)光強(qiáng)度等條件無關(guān)，而與其自身結(jié)構(gòu)和所處的微環(huán)境，例如溫度、極性、pH 值等有關(guān)，時(shí)間分辨熒光（TRF）檢測技術(shù)正是利用該性質(zhì)，在熒光壽命維度來區(qū)分樣品信號。常規(guī)的 TRF 技術(shù)有兩條主要技術(shù)路線，分別是熒光壽命成像（Fluorescence Lifetime Imaging，F(xiàn)LIM）技術(shù)和時(shí)間分辨熒光免疫分析（Time-Resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）技術(shù)。

熒光壽命成像 FLIM 技術(shù)于 1989 年S次由 I. Bugiel 等人[2]報(bào)道，利用亞納秒時(shí)間分辨熒光激光掃描顯微鏡成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平的研究。近幾十年該技術(shù)發(fā)展出了以 CCD 相機(jī)或者超高速相機(jī)為基礎(chǔ)的寬場成像和以脈沖激光為基礎(chǔ)的共聚焦成像兩大類，并基于時(shí)域和頻域的原理形成了多種 FLIM 技術(shù)，但均擁有鮮明的優(yōu)缺點(diǎn)。除結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致的系統(tǒng)搭建難度較大以外，要么分辨率和信噪比較高但難以測量動態(tài)樣品，要么采集速度快但對樣品信號強(qiáng)度有要求。市面上成熟的商業(yè)化方案也較少，Leica Microsystem 推出的 FALCON 熒光壽命成像系統(tǒng)為其代表。

時(shí)間分辨熒光免疫分析 TRFIA 技術(shù)則是將時(shí)間分辨熒光與免疫分析技術(shù)相結(jié)合，屬于一類非放射性標(biāo)記技術(shù)。TRFIA 以三價(jià)鑭系元素離子或其螯合物，例如銪（Eu）、鋱（Tb）、釤（Sm）和鏑（Dy）為標(biāo)記物，來代替常用的熒光物質(zhì)對抗原抗體進(jìn)行標(biāo)記，并使用帶有時(shí)間分辨熒光檢測功能的儀器如酶標(biāo)儀來對熒光強(qiáng)度信號進(jìn)行檢測，Z 終繪制標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線，定量分析待測物的濃度。

圖1 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)基本原理

對一些常見的熒光基團(tuán)來說，其熒光壽命普遍處于 10-100 ns 左右，而鑭系元素及其螯合物的熒光壽命可達(dá) 103-106 ns，因此在檢測信號時(shí)（圖 1），利用兩次激發(fā)光脈沖的間隔，等待雜散信號的壽命衰減之后再進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測，可以大大減少其他信號的干擾，提高信噪比和靈敏度。

在稀土元素的選擇上，銪的三價(jià)離子（Eu3+）在生物研究領(lǐng)域Z為常用，其熒光壽命約 1ms，激發(fā)光波長通常在 330nm 左右，發(fā)射光波長通常在 610nm 左右，引入適當(dāng)?shù)呐浜衔锵到y(tǒng)以后，能使銪在水溶液中更加穩(wěn)定，并且熒光強(qiáng)度可增強(qiáng)數(shù)十倍[3]。而鋱的三價(jià)離子（Tb3+）配合物的激發(fā)光波長通常在 290nm 左右，發(fā)射光波長通常在 540nm 左右，該發(fā)射光波段處于許多常見生物熒光基團(tuán)的波段范圍內(nèi)，且熱動力學(xué)穩(wěn)定性較差，并具有一定的細(xì)胞毒性，因此與銪離子相比在生物領(lǐng)域使用略少，但在材料學(xué)領(lǐng)域使用前景廣闊。此外釤（Sm3+）也偶有應(yīng)用，比如銪與釤的雙標(biāo)記。

隨著 TRFIA 的應(yīng)用逐漸廣泛，其中一類衍生技術(shù)也逐漸被大家所熟知，即均相時(shí)間分辨熒光 HTRF （Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）。該技術(shù)將時(shí)間分辨熒光 TRF 和熒光共振能量轉(zhuǎn)移 FRET 相結(jié)合，使用銪（Eu3+）或鋱（Lumi4 - Tb）的穴狀化合物作為供體，熒光團(tuán)（ XL665 或小分子 d2 ）作為受體[4]。當(dāng)供體和受體距離足夠近時(shí)，供體被一個(gè)能量源激發(fā)，可以引發(fā)能量轉(zhuǎn)移到受體，使其在特定波長發(fā)出熒光，用于檢測生物分子之間的相互作用。

Molecular Devices 公司旗下 M 系列、iD5、i3x、Paradigm 等多款型號的多功能酶標(biāo)儀均可配備 TRF 檢測功能，并提供經(jīng) Cisbio 認(rèn)證的 HTRF 功能模塊可供選擇，獲得高靈敏度和寬動態(tài)范圍的數(shù)據(jù)。

綜上所述

TRF 技術(shù)已經(jīng)逐步發(fā)展成熟，并擴(kuò)展出了諸多使用方向，拓展了研究人員的工具庫，相信未來此類技術(shù)一定會得到更加廣泛的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李振甲, 陳泮藻, 高　平. 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)

與應(yīng)用[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1996. 16~31

[2] I. Bugiel, K. K¨onig and H. Wabnitz, Investigation of cells by

fluorescence laser scanning microscopy with subnanosecond time resolution, Lasers Life Sci., 1989, 3, 47–53.

[3] 戚玉華，許崇娟，趙洪光，等． 镥對銪-諾氟沙星體系

的熒光增強(qiáng) 效應(yīng)［J］． 濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)( 自然科學(xué)版) ，

[4] https://www.cisbio.net/content/htrf-technology-basics