可視化生命分子動力學

理解復雜而快速的細胞動力學是探索生物過程的重要一步。當今的生命科學研究越來越關注實時動態過程，如細胞遷移，細胞、器官或整個動物的形態變化以及活體標本的實時生理事件（例如細胞內離子組分的變化）。解決這些挑戰性需求的一種方式是采用被統稱為活細胞成像的光學方法。

活細胞成像實時提供細胞或生物體在其自然環境中的當前狀態的“快照”，而不會人為引入一些假象。這些特點讓活細胞成像成為解決細胞生物學、癌癥研究、發育生物學和神經科學問題的必要技術。

近年來，電子學、光學和分子生物學都取得了重大進步，科學家們可以很容易地進行活細胞成像。

活細胞熒光成像需要考慮如下因素：

維持樣品生理條件

在你的實驗中要考慮的最重要的事情是在樣品準備和成像過程中保持你的樣品的活力和健康度。因此，將樣品保存在盡可能接近生理條件的環境中是至關重要的，即溫度、pH、氧氣水平和其他重要因素。

減小光壓力

將活細胞暴露在光線下會產生光毒性和標本生理上的變化，所以你可能會得到與正常生理條件下實際發生的情況不同的結果。為了盡可能避免光毒性，寬場顯微鏡通常是活體標本成像的首 選技術。他們用低劑量的LED光照射樣品以激發熒光團，圖像采集比其他顯微鏡方法如共焦成像更快。

樣品的標記

在對活標本進行成像時，熒光蛋白通常是標記要研究事件發生的標本結構的首 選工具，因為與其他標記相比，這些蛋白質的毒性通常較小，并繞過了抗體無法進入細胞的問題。熒光蛋白質技術依賴于基因編碼的熒光團，可用于跟蹤活細胞中標記的生物分子及其相互作用等。同時使用多個熒光蛋白，稱為多色或多路成像，允許您同步觀察多個細胞結構和過程，提供更多生理相關的結果，從而為測量增加背景(例如，使用其他標記進行活/死細胞分析或進行多色小泡觀察實驗)。

用于活細胞成像的方法

眾多顯微技術被應用于活細胞成像。通常，細胞的生長、細胞聚集體或細胞運動是通過使用復合顯微鏡以及像相差和微分干涉 (DIC)這樣的方法來觀察的。對更大的標本，如發育中的斑馬魚胚胎進行延時成像，通常使用立體顯微鏡或宏觀顯微鏡。

這篇文章的重 點是熒光顯微鏡技術，這些技術在過去幾十年中變得更加突出。這篇簡短的概述涵蓋了常用的定量方法，以及寬場顯微鏡常用的光操作技術。

離子成像

觀察離子濃度的變化

由于細胞胞漿中的離子組成決定了許多重要的功能，如神經元的興奮性、基因轉錄和細胞運動，細胞內離子在空間和時間上的調節是生命科學研究的主要熱點之一。離子成像(鈣、氯、鎂)是一種常用的方法，它使用熒光染料或特別設計的蛋白質，以改變其在鈣結合時的發射行為。這使研究人員能夠觀察細胞離子濃度的動態變化。此外，使用特殊的熒光染料可以對細胞內的pH值或電壓進行成像。一種用來對離子水平、pH值或電壓變化進行成像的特殊技術是比率成像法。這些方法能夠精確測定細胞內鈣濃度等信息，而不像非比率方法那樣監測相對變化。

TIRF

觀察靠近細胞膜的過程

全內反射熒光（TIRF）是一種特殊的技術，用于觀察位于細胞質膜或靠近質膜的事件。通過使用僅穿透細胞60-250 nm的熒光激發的消逝場，TIRF顯微鏡提供了無與倫比的z軸分辨率，使得能夠對發生在質膜內或靠近質膜的事件進行成像，例如，分子向質膜的運輸。TIRF避免了被細胞內部更深的分子發出的熒光信號淹沒的問題。

TIRF圖像

靠近膜的Galectin-3（半乳糖凝集素3）囊泡沿肌動蛋白絲的運輸。

圖1：A)落射熒光的圖像；B)TIRF圖像，框選部分詳見C部分；C)：TIRF成像的時間序列結果；時間以秒為單位。箭頭指示靠近膜的Galectin-3囊泡（用YFP標記）首先沿著肌動蛋白絲（從底部向上）運輸，轉移到另一條肌動蛋白絲（88秒），向左移動（109秒），再向右運輸，再次轉換肌動蛋白絲，然后向上運輸（246秒）。

YFP：紅色；CFP：綠色；概覽圖像的標尺：20 μm；厚度：6 μm；TIRF穿透深度：110 nm。由德國馬爾堡大學的Ralf Jacob提供

FRET和BRET

量化蛋白質-蛋白質相互作用

要檢測動態蛋白質相互作用，可以在活細胞實驗中對FRET（熒光共振能量轉移）和BRET（生物發光共振能量轉移）事件進行成像。FRET是量化分子動力學的有利工具，如蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白質-DNA相互作用和蛋白質構象變化等。FRET成像通常使用GFP（綠色熒光蛋白）的衍生物，尤其是CFP和YFP（分別為青色和黃色熒光蛋白），它們各自使用分子生物學方法連接到感興趣的目的蛋白質上。然后用相應熒光激發CFP分子。一旦目的蛋白質在空間上接近（<20 nm），CFP將作為供體并以光的形式發射能量轉移給作為受體的YFP。研究人員將觀察到從CFP發出的藍色熒光轉變為從YFP發出的黃色熒光。使用BRET時，供體是生物發光分子（例如熒光素酶衍生物），與FRET一樣，GFP衍生物作為受體。

圖2：擬南芥的共聚焦活細胞圖像；內質網：GFP標記為綠色，自發熒光葉綠體為紅色，透射光為藍色。基于這樣的圖像，可以完成FRET或FRAP等分析。

FRAP

監測蛋白質和囊泡轉運

光漂白后熒光恢復（FRAP）是一種常用的監測蛋白質或囊泡轉運的方法。熒光蛋白（通常是GFP）附著在目的蛋白質上（即要監測此蛋白質的運動）。通常情況下，整個細胞最初發出熒光，因為整個細胞中可能含有豐富的該蛋白質。然后細胞的某個區域，通常是神經元細胞中的細胞突起，如軸突或樹突，暴露在高強度的光下（通常是激光），該特定區域的熒光被破壞（漂白）。隨著目的蛋白質的移動，來自細胞其他區域的蛋白質會以一定的速度重新侵入漂白區域，然后漂白區域的熒光恢復。這能讓研究人員深入了解胞內運輸動力學。

光活化

監測基因表達和蛋白質轉運

最近開發的一種被稱為光活化的方法能夠選擇性地 標記細胞或整個生物體內的特定區域或感興趣區域。進行光活化時，使用專門設計的染料或熒光蛋白，如光活化綠色熒光蛋白(paGFP)或Kaede。這些熒光團在正常狀態下不發熒光。但在用特定波長的光照射后，它們可以像傳統熒光團一樣被激活，發出熒光。在很多情況下，將這些蛋白質與某些目的蛋白質進行基因融合，可以監測其表達或轉運。然后可以應用FRAP或粒子跟蹤等方法來進一步研究目的蛋白質。

MPE

深入研究進程

在細胞培養實驗中，現代生物學研究需要真正的體內研究來補充“類似體內”研究。但很難研究像小鼠這樣的生物體內發生的過程。多光子激發（MPE）顯微鏡能夠更深入地穿透組織，因為與用于單光子激發的短波長光相比，近紅外激發光具有更長的波長，散射更少。MPE技術的非線性特性將光漂白和光毒性限制在焦點區域。這對長期研究非常有益，因為熒光蛋白和生物體都受到這些問題的困擾。據報告，使用合適的標本和顯微鏡設置，成像深度可以深入組織中數毫米。激發的精確定位使其也適用于光子操縱。該方法在神經生物學中得到了廣泛的應用。

FLIM

活細胞的空間測量

熒光壽命成像的優點是數據不依賴于信號強度。因此不受光漂白和濃度變化等常見偽影的影響。使用時間相關的單光子計數，通過單分子檢測數據重建FLIM圖像。可以記錄和分析亞納秒熒光壽命的最小變化。該方法可用于研究導致熒光壽命改變的任何類型的細胞外和細胞內環境改變。基于FLIM的FRET分析對發射強度不敏感，從而提高了定量數據的精度。

CARS和SRS

使用振動對比的無標記方法

幾乎所有的活細胞熒光成像方法都基于熒光蛋白的基因表達。這涉及到大量的技術工作和高昂的費用。此外，外部基因的表達可能會改變微環境，從而導致數據與實際生理學情況的差異。相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡和受激拉曼散射（SRS）顯微鏡是不依賴于熒光染料的非線性共聚焦方法。這些無標記方法可對樣品中特定化學鍵的振動狀態進行成像。生物體中特定化學鍵的積累，例如軸突周圍髓鞘中的脂質，可以在無需染色的情況下以高分辨率和出色的信噪比質量進行成像。

未來需要更多的定量分析 ?

生物學研究已經從單純的描述性調查進入到定量分析的時代。新的活細胞成像技術正在朝著更高分辨率的方向發展，無論是在空間上還是在時間上。技術發展現在正集中于對動態事件的定量研究，使這些方法更容易獲得，并為充分回答研究問題奠定了基礎。