PCR的反應(yīng)控制
PCR技術(shù)是模擬體內(nèi)DNA的天然復(fù)制過程，在體外擴(kuò)增DNA分子的一種分子生物學(xué)技術(shù)，主要用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。在待擴(kuò)增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2倍。
反應(yīng)的控制
①PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子
②鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L
③底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L
④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
⑤引物 濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L
⑥反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)
變性溫度和時(shí)間 95℃，30s
退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸溫度和時(shí)間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。
模板的制備
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。
標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。
全部評(píng)論(0條)
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