DNA提取過(guò)程中細(xì)胞裂解原理和方法
核酸提取儀是應(yīng)用配套的核酸提取試劑來(lái)使得樣本核酸提取工作自動(dòng)完成的儀器。其在環(huán)境微生物檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、輸血安全、法醫(yī)學(xué)鑒定、疾病控制ZX、臨床疾病診斷、生物學(xué)研究以及畜牧業(yè)等多種領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用。下面就讓小編帶你了解一下DNA提取過(guò)程中細(xì)胞裂解原理和方法。
裂解原理
細(xì)胞裂解對(duì)于核酸提取是非常的重要的，去污劑(如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等)和鹽(如Tris、EDTA、NaCl等)一般都包含在經(jīng)典的裂解液中。鹽不僅起到提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境(如Tris)的作用，還包括對(duì)樣品中的核酸酶在裂解過(guò)程中對(duì)核酸的破壞(如EDTA)的YZ，使核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定(如NaCl)得以維持等的作用。去污劑通過(guò)使蛋白質(zhì)變性，對(duì)膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞以及與核酸相連接的蛋白質(zhì)將解開(kāi)，從而使核酸在裂解體系中游離得以實(shí)現(xiàn)。裂解體系中還可能將蛋白酶加入其中，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，對(duì)分開(kāi)核酸與蛋白質(zhì)起到促進(jìn)作用。同時(shí)，也為后面的純化操作以及獲得更純的核酸提供了方便，裂解也有直接對(duì)高濃度的蛋白質(zhì)變性劑(如GIT、GuHCl等)進(jìn)行使用的，該方法雖然不是基因組DNA抽提的主流，卻是RNA抽提的主流。
細(xì)菌細(xì)胞破碎方法有以下幾種：
1.反復(fù)凍融法
在-20度以下冰凍細(xì)胞，在室溫下融解，反復(fù)多次，因?yàn)楸Ｔ诩?xì)胞內(nèi)形成和了剩余細(xì)胞液的鹽濃度而造成溶脹，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。
2.酶解法
將溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶K等加入，均能夠?qū)е录?xì)胞壁破碎，釋放出核酸。蛋白酶還可以對(duì)與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，對(duì)核酸的分離起到了促進(jìn)作用。其中溶菌酶可以對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1,4)鍵水解起到催化作用。其存在去污劑(0.5%SDS或1%TritonX-100)和EDTA、尿素(1～4mol/L)以及溫度65℃的情況下依然有酶活性保留，此對(duì)高分子量核酸的提取效率的提高非常的有利。在實(shí)際工作中,經(jīng)常將酶作用、機(jī)械作用、化學(xué)作用聯(lián)合起來(lái)使用。按照細(xì)胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)決定具體選擇哪種或哪幾種方法。
3.機(jī)械方法：
勻漿法、研磨法、超聲波處理法，關(guān)于超聲波處理法，需要將超聲時(shí)間和間隙時(shí)間設(shè)定好，通常超聲時(shí)間不超過(guò)5秒，間隙時(shí)間Z好大于超聲時(shí)間。
4.化學(xué)試劑法
使用含SDS或CTAB的溶液來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，在一定的pH環(huán)境和變性條件下,細(xì)胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相，由加入的強(qiáng)堿(NaOH)或緩沖液(TE、STE等)提供了pH環(huán)境，表面活性劑或強(qiáng)離子劑能夠?qū)е录?xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀。緩沖液中的一些金屬離子螯合劑(EDTA等)能夠?qū)怂崦富钚运仨毜慕饘匐x子Mg2+、Ca2+進(jìn)行螯合，從而使核酸酶的活性得到Y(jié)Z，對(duì)核酸進(jìn)行保護(hù)，使其不會(huì)被降解。
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