在4種維生素E異構體測試過程中，該如何進行鍵合相的選擇？是否遇到過β-生育酚和γ-生育酚分離不理想、峰形差、柱壓高等問題？面臨這些問題，我們該如何排查和解決？

一、鍵合相的選擇

      首先我們看一下4種維生素E的結構（如圖1.1），對于反相分離模式，我們通常從極性差異來判斷能否分離，從非極性看，α-生育酚>β-生育酚≈γ-生育酚>δ-生育酚，用常規C18色譜柱，意料之中，β-生育酚和γ-生育酚由于非極性差異太小，不能實現分離（如圖1.2）。

圖1.1  維生素E結構式

圖1.2  C18分離4種維生素E異構體譜圖

      同樣屬于反相分離模式，為什么C30色譜柱可以實現2種物質的分離呢（譜圖見后續二、三、四部分）？

       首先我們看下C30色譜柱，和C18色譜柱相比，烷基鏈更長，由于填料的孔徑都是約為120?，孔表面鍵合的烷基鏈越長，不同位置鍵合的烷基鏈交叉重疊的可能性增大，待測組分通過孔內的阻力增大，C30分離β-生育酚和γ-生育酚依靠的是空間位阻作用。

二、“峰形差”怎么辦？

2.1 流速的影響

色譜條件：

色譜柱：Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)

柱溫：20℃

流速：0.8ml/min

進樣量：10μl

紫外檢測波長：維生素E為294nm

流動相：A：甲醇     B：水

測試結果：

      按照GB5009.82-2016第1法中色譜條件，我們發現β-生育酚拖尾，為了排查β-生育酚拖尾原因，首先嘗試將流速調為0.9ml/min，β-生育酚不拖尾，在27.8min附近多一個鼓包，干擾α-生育酚的定量，不進樣走流動相，也有該鼓包，說明是流動相梯度混合產生的基線波動，流速為0.8ml/min時，基線鼓包和β-生育酚出峰接近，造成β-生育酚拖尾。繼續增大流速至1.0ml/min，目標物出峰時間提前，α-生育酚和基線鼓包可以分開。

      按照GB5009.82-2016DY法中色譜條件，采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)，通過增大流速，可以避免基線波動對目標峰的干擾，另外β/γ-生育酚的分離度也得到改善。具體結果見表2.1。

表2.1 不同流速條件的結果分析

2.2 流動相的影響

      既然上述條件，β-生育酚“拖尾”是由于梯度程序造成，考慮到整個梯度程序流動相的組成差異很小，我們直接采用甲醇為流動相，也可以避免基線鼓包造成的峰形差等干擾。

總結：

      該案例中的“峰形差”是梯度流動相梯度混合產生的基線波動造成的假象，通過增大流速或者將流動相調為甲醇即可解決。

三、β-生育酚和γ-生育酚分離不理想怎么辦？

3.1 流速的影響

      參考表2.1，增大流速后可以避免基線波動對目標峰的干擾，另外β/γ-生育酚的分離度也得到改善。流速是怎么影響β-生育酚和γ-生育酚分離度的呢？還是要從分離度的計算公式來看，

      增大流速后，由于色譜柱和流動相種類沒有變化，選擇性α保持不變，由于整個梯度程序，流動相的組成變化不大，所以k變化較小，而β-生育酚和γ-生育酚的柱效提高，所以分離度得到改善。

3.2 柱溫的影響

      采用甲醇為流動相時，參考2.2中結果，β/γ-生育酚的分離度只有1.55，勉強達到基線分離，我們嘗試將柱溫降低為15℃，β-生育酚和γ-生育酚的分離度明顯得到改善，達到1.90。

      柱溫是怎么影響分離度的呢？柱溫的影響相對比較復雜，它對柱效、選擇性和保留因子都有影響，從而對分離度產生影響，這里就不詳細分析柱溫對每個參數的影響程度了。這個案例說明β/γ-生育酚的分離對柱溫比較敏感，遇到分離度的問題時可以考慮降低柱溫。

總結：

      β-生育酚和γ-生育酚分離不理想，梯度條件，可以通過增大流速解決，甲醇做流動相等度條件下，可以通過降低柱溫解決。

四、有沒有更好的選擇？

      我們發現，用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm(PN: LAEQ-462552)，粒徑從3 μm增大為5 μm，在滿足分離度的前提下，系統壓力更低哦，見表3.1。

表3.1 不同色譜條件下的對比

總結：

       采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552)，甲醇做流動相，可以實現更優的結果，α-生育酚出峰時間早、β/γ-生育酚分離度好、柱壓更低。

五、總結

      5.1 遇到“峰形差”問題，首先排查是否流動相的影響，可以通過空走流動相來確認，該案例中的“峰形差”是梯度流動相梯度混合產生的基線波動造成的假象，通過增大流速或者將流動相調為甲醇即可解決。

5.2 β-生育酚和γ-生育酚分離不理想，梯度條件，可以通過增大流速解決，甲醇做流動相等度條件下，可以通過降低柱溫解決。

      5.3 采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552)，甲醇做流動相，可以實現更優的結果，α-生育酚出峰時間早、β/γ-生育酚分離度好、柱壓更低。