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  走巴走巴 2007-06-28 00:00:00

  提取目的基因，目的基因與運載體結合，目的基因導入受體細胞，目的基因的檢測與鑒定。

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  towerrt 2007-06-28 00:00:00

  基因工程的基本過程： 1、材料的準備：目的基因、載體、工具酶和受體細胞（宿主）的準備。用相同的限制 性內切酶分別將外源DNA和載體分子切開，以產生相同的黏性末端。 2、 將目的基因與載體DNA進行體外重組，形成重組DNA分子。 3、 將重組的DNA分子引入受體細胞，并建立起無性繁殖系。 4、 篩選出所需要的目的無性繁殖系，并保證外源基因在受體細胞中穩定遺傳、正確 表達。 可將基本步驟概括為：切、接、轉、增、檢。

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  一只小鳥5711 2016-12-01 17:48:01

  是基因工程吧 基因工程簡介 我們常常說基因是生物體進行生命活動的“藍圖”，這是因為生物體可以通過基因的特異性表達，來完成各種生命活動。例如，青霉菌能夠產生出對人類有用的抗生素——青霉素；豆科植物的根瘤菌能夠固定空氣中的氮；家蠶能夠吐出絲……那么，人們能不能通過改造生物體的基因，定向地改變生物的遺傳特性呢？比如，通過對基因進行改造和重新組合，讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮，讓細菌“吐出”蠶絲，讓微生物生產出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物。科學家們經過多年的努力，終于在20世紀70年代，創立了一種能夠定向改造生物的新技術——基因工程。那么，什么是基因工程呢？基因工程又是怎樣改變生物遺傳特性的呢？ 一 基因工程的基本內容 基因工程又叫做基因拼接技術或DNA重組技術。這種技術是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞內進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內表達，產生出人類所需要的基因產物。通俗地說，就是按照人們的主觀意愿，把一種生物的個別基因復制出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。 基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。DNA分子的直徑只有2.0nm(粗細只有頭發絲的十萬分之一)，其長度也是極其短小的。如流感嗜血桿菌的DNA，長度只有0.83?m，即使是較大的大腸桿菌，其長度也只有1.36?m。要在如此微小的DNA分子上進行剪切和拼接，是一項非常精細的工作，必須要有專門的工具。 基因操作的工具 用什么樣的工具才能準確無誤地對基因進行剪切和拼接呢？這是從事基因工程研究的科學家首先遇到的難題。例如，通過基因工程培育抗蟲棉時，就需要將抗蟲的基因從某種生物(如蘇云金芽孢桿菌)中提取出來，“放入”棉的細胞中，與棉細胞中的DNA結合起來，在棉中發揮作用。這里遇到的難題主要有兩個：首先是蘇云金芽孢桿菌的一個DNA分子有許多基因，怎樣從它的DNA分子的長鏈上辨別出所需要的基因，并且把它切割下來。其次是如何將切割下來的抗蟲基因與棉的DNA“縫合”起來。為了突破這些難關，科學家進行了許多試驗，Z后他們發現了一種“基因剪刀”和“基因針線”，可以用來完成基因的剪切和拼接。 基因的剪刀——限制性內切酶 基因的剪刀指的是DNA限制性內切酶(以下簡稱限制酶)。限制酶主要存在于微生物中。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子(如圖)。例如，從大腸桿菌中發現的一種限制酶只能識別GAATTC序列，并在G和A之間將這段序列切開。目前已經發現了二百多種限制酶，它們的切點各不相同。蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲基因，就能被某種限制酶切割下來。 基因的針線——DNA連接酶 從圖中可以看出，被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫做黏性末端。可以設想，如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，似乎就可以合成重組的DNA分子了。但是，實際上僅僅這樣做是不夠的，互補的堿基處雖然連接起來，但是這種連接只相當于把斷成兩截的梯子中間的踏板連接起來，兩邊的扶手的斷口處還沒有連接起來(如圖)。要把扶手的斷口處連接起來，也就是把兩條DNA末端之間的縫隙“縫合”起來，還要靠另一種極其重要的工具——DNA連接酶。 基因的運輸工具——運載體 要將一個外源基因，如上面所說的抗蟲基因，送入受體細胞，如棉細胞，還需要有運輸工具，這就是運載體。作為運載體的物質必須具備以下條件：能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存；具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；具有某些標記基因，便于進行篩選。目前，符合上述條件并經常使用的運載體有質粒、噬菌體和動植物病毒等。 質粒是基因工程Z常用的運載體，它廣泛地存在于細菌中，是細菌染色體外能夠自主復制的很小的環狀DNA分子，大小只有普通細菌染色體DNA的百分之一(如圖)。質粒能夠“友好”地“借居”在宿主細胞中。一般來說，質粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性的作用。但是，質粒的復制則只能在宿主細胞內完成。 大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌等細菌中都有質粒。因為土壤農桿菌很容易感染植物細胞，所以科學家培育轉基因植物時，常常用土壤農桿菌中的質粒做運載體。 基因操作的基本步驟 進行基因操作一般要經歷四個基本步驟，也就是基因操作的“四步曲”。 提取目的基因 基因操作的diyi步，是取得人們所需要的特定基因，也就是目的基因(如圖)。如前 面提到的蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲基因，還有植物的抗病(抗病毒、抗細菌)基因、 種子的貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等，都是目的基因。 要從浩瀚的“基因海洋”中獲得特定的目的基因，猶如大海撈針，是十分不易的。科學家們經過不懈地探索，想出了許多辦法，概括地說，主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。 直接分離基因Z常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。這種方法猶如用發射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標，都能把鳥打下來。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制(在遺傳學中叫做擴增)，從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲、抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。 用“鳥槍法”獲取目的基因的缺點是工作量大，具有一定的盲目勝。又由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段，不能直接用于基因的擴增和表達，因此，在獲取真核細胞中的目的基因時，一般是用人工合成基因的方法。 目前人工合成基因的方法主要有兩條途徑。一條途徑是以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據已知的蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學的方法，以單核苷酸為原料合成目的基因(如圖)。如人的血紅蛋白基因、胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。 20世紀80年代以后，隨著DNA核苷酸序列分析技術的發展，人們已經可以通過DNA序列自動測序儀(見本章題圖左上照片)對提取出來的基因進行核苷酸序列分析，并且通過一種擴增DNA的新技術(也叫PCR技術)，使目的基因片段在短時間內成百萬倍地擴增。上述新技術的出現大大簡化了基因工程的操作技術。 目的基因與運載體結合 將目的基因與運載體結合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質粒作為運載體，首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個切口，露出黏性末端。然后用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。將切下的目的基因的片段插入到質粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，質粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會因堿基互補配對而結合，形成了一個重組DNA分子(如圖)。如人的胰島素基因就是通過這種方式與大腸桿菌中的質粒DNA分子結合，形成重組DNA分子(也叫重組質粒)的。 將目的基因導入受體細胞 目的基因的片段與運載體在生物體外連接形成重組DNA分子后，下一步是將重組DNA分子引入受體細胞中進行擴增(如圖)。 基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。 用人工的方法使體外重組的DNA分子轉移到受體細胞，主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。例如，如果運載體是質粒，受體細胞是細菌，一般是將細菌用氯化鈣處理，以增大細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。目的基因導入受體細胞后，就可以隨著受體細胞的繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內就能夠獲得大量的目的基因。 目的基因的檢測和表達 以上步驟完成以后，在全部受體細胞中，真正能夠攝入重組DNA 分子的受體細胞是很少的。因此，必須通過一定的手段對受體細胞中是否導入了目的基因進行檢測。檢測的方法有很多種，例如，大腸桿菌的某種質粒具有青霉素抗性基因，當這種質粒與外源DNA組合在一起形成重組質粒，并被轉入受體細胞后，就可以根據受體細胞是否具有青霉素抗性來判斷受體細胞是否獲得了目的基因。 重組的DNA分子進入受體細胞后，受體細胞必須表現出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程。例如，科學家Z初做抗蟲棉試驗時，雖然已經檢測出棉的植株中含有抗蟲的基因，但讓棉鈴蟲食用棉的葉片時，棉鈴蟲并沒有被殺死，這說明抗蟲基因還不能在高等植物中表達。科學家在研究的基礎上，又一次對棉植株中的抗蟲基因進行了修飾，然后再讓棉鈴蟲食用棉的葉片，結果食用的第二天棉鈴蟲就中毒死亡了。這說明抗蟲基因在棉植株中得到了表達

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