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  晧瀚 2013-10-13 00:00:00

  哪些樣本不好測？ 當客戶把成批的樣品交給商業化的測序公司時，經常會被告知一些樣本沒有結果，或是測得不好，無法提供圖譜。做為客戶常常不清楚測序失敗的原因，對于一些重要的樣品只好改送另外的測序公司試試看。DNA 測序失敗的原因歸納起來有三種： 一是模板的原因，模板的質量很重要，加入反應里的模板“量”并不很嚴格，但是模板“純度”要求很高。這就是為什么商業測序公司通常要自已提取模板的原因。控制好模板是提高測序成功率的關鍵因素。對于一個經過訓練，實驗操作穩定的人來說，使用商品化成套試劑盒處理的DNA模板的質量會有保證。其次，DNA模板不能被污染，也就是說在挑菌落，細菌培養過程要防污染。如果菌生長的不好，提出來的模版測序效果也不好。 如果DNA模板的質量沒問題，有一段區域總是測不通，那就要考慮模板本身存在“難通過”的結構了。基因組中一些高度重復序列，GC 富集序列，Poly A/T 序列 通常都是測序的“難點”，相對于質粒模板，PCR 產物的測序效果要差很多。 二是引物的原因，測序的引物除了通用引物就是PCR 的特異引物了。測不出時考慮更換新的引物或者改換另一個方向來測。（注意：即使是同一個模板，正反引物測序的效果可能相差巨大）。雖然很多時候使用PCR 擴增引物來做測序引物，但是測序對引物的特異性要求很高。如果引物與模板的非特異退火，延伸會導致“套峰”樣結果。測序失敗。 三是測序反應條件的原因，目前DNA測序的原理是基于“酶”促反應的Sanger 法，如果模板與引物匹配性不好，自然不會延伸出DNA 片段；如果反應條件不合適，同樣沒用反應結果。當商業測序公司使用一個反應條件來測所有的樣本時，某些樣本的失敗就不足為奇了。

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