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  yewenba主 2017-09-15 19:43:49

  　　青霉素生產(chǎn)工藝過程 　　一、青霉素的發(fā)酵工藝過程 　　1、工藝流程 　　（1）絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程 　　冷凍管（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）——大米孢子（26°C，種子培養(yǎng)56h，1:1.5vvm）——一級(jí)種子培養(yǎng)液（27°C，種子培養(yǎng)，24h，1:1.5vvm）——二級(jí)種子培養(yǎng)液（27~26°C，發(fā)酵，7天，1:0.95vvm）——發(fā)酵液。 　　（2）球狀菌二級(jí)發(fā)酵工藝流程 　　冷凍管（25°C，孢子培養(yǎng)，6~8天）——親米（25°C，孢子培養(yǎng)，8~10天）——生產(chǎn)米（28°C，孢子培養(yǎng)，56~60h，1:1.5vvm）——種子培養(yǎng)液（26~25-24°C，發(fā)酵，7天，1：0.8vvm）——發(fā)酵液。 　　2、工藝控制 　　（1）影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素 　　基質(zhì)濃度 在分批發(fā)酵中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏（或YZ）或?qū)z生長產(chǎn)生YZ（如葡萄糖和錢的阻遏或YZ ， 的生長YZ）， 而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成 ， 為了避免這一現(xiàn)象 ， 在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法 ， 即對(duì)容易產(chǎn)生阻遏、YZ和限制作用的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的Z適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加 ， 因?yàn)榧词故浅鯶適濃度范圍較小的波動(dòng) ， 都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制 ， 使生物合成速度減慢或停止。目前 ， 糖濃度的檢測尚難在線進(jìn) 行 ， 故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制 ， 而是間接根據(jù)pH 值、溶氧或 C02 釋放率予以調(diào)節(jié)。 　　（2）溫度 青霉素發(fā)酵的Z適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別 ， 但一般認(rèn)為應(yīng)在25 °C 左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率 ， 同時(shí)增加葡萄糖的維持消耗 ， 降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生長和青霉素合成來說 ， Z適溫度不是一樣的， 一般前者略高于后者， 故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的溫度，以縮短生長時(shí)間， 到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 ， 以利于青霉素的合成。 　　（3） pH 值 青霉素發(fā)酵的Z適 pH 值一般認(rèn)為在 6. 5 左右 ， 有時(shí)也可以略高或略低一些 ， 但應(yīng)盡量避免 pH 值超過7.0， 因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定， 容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中， pH 值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。過高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積累使 pH 值降低； 過低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起 pH 值上升。 　?。?）溶氧 對(duì)于好氧的青霉素發(fā)酵來說 ， 溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到 30% 飽和度以下時(shí)， 青霉素產(chǎn)率急劇下降， 低于 10% 飽和度時(shí)， 則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高 ， 說明菌絲生長不良或加糖率過低， 造成呼吸強(qiáng)度下降， 同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡點(diǎn)， 而氧消耗與碳能源消耗成正比， 故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個(gè)參考指標(biāo)。 　?。?）菌絲濃度 發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度， 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達(dá)到平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強(qiáng)度 (取決于維持因數(shù)的大小， 維持因數(shù)越大，呼吸強(qiáng)度越高) 、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強(qiáng)度低的菌株降低發(fā)酵中氧的消耗速率，而通氣與攪拌能力強(qiáng)的發(fā)酵罐及黏低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升， 從而提高臨界菌體濃度。 　?。?）菌絲生長速度 用恒化器進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)證明，在葡萄糖限制生長的條件下，青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長速率之間呈一定關(guān)系。當(dāng)比生長速率低于0.015h-1時(shí)，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比， 當(dāng)比生長速率高于 O. 015h-1時(shí)， 比生產(chǎn)速率與比生長速率無關(guān) D 因此， 要在發(fā)酵過程中達(dá)到并維持Z大比生產(chǎn)速率， 必須使比生長速率不低0.015h-1 。這一比生長速率稱為 臨界比生長速率。對(duì)于分批補(bǔ)料發(fā)酵的生產(chǎn)階段來說， 維持0.015h斗的臨界比生長速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍， 這在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中是很難實(shí)現(xiàn)的。事實(shí)上 ， 青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多， 卻仍然能達(dá)到很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補(bǔ)料分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶， 抵消了一部分生長， 故雖然表觀比生長速率低， 但真比生長速率卻要高一些。 　?。?）菌絲形態(tài) 在長期的菌株改良中 ， 青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸， 故一般比生產(chǎn)速率較高； 后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低， 使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高， 從而允許更多的菌絲生長 (即臨界菌體濃度較高)， 發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。 　　在絲狀菌發(fā)酵中， 控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L度， 并避免結(jié)球 ， 是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中， 使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊 ， 并盡量減少游離菌絲的含量， 也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強(qiáng)度及比生長速率密切相關(guān)。 　　3、 工藝控制要點(diǎn) 　?。?）種子質(zhì)量的控制 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上，25 °C 培養(yǎng) 7 天， 真空干燥并以這種形式保存?zhèn)溆?。生產(chǎn)時(shí)它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內(nèi) ，26 °C 培養(yǎng) 56h 左右， 菌絲濃度達(dá)6%-8%， 菌絲形態(tài)正常， 按 10%-15%的接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級(jí)種子罐內(nèi)，27°C 培養(yǎng) 24h， 菌絲體積 10%-12%， 形態(tài)正常， 效價(jià)在700D/ml左右便可作為發(fā)酵種子。 　　球狀菌的生產(chǎn)種子是由冷凍管子孢子經(jīng)混有O. 5% -1. 0 %玉米漿的三角瓶培養(yǎng)原始親米孢子， 然后再移人羅氏瓶培養(yǎng)生產(chǎn)大米抱子 (又稱生產(chǎn)米)， 親米和生產(chǎn)米均為25 °C靜置培養(yǎng)， 需經(jīng)常觀察生長發(fā)育情況在培養(yǎng)到 3-4 天， 大米表面長出明顯小集落時(shí)要振搖均勻， 使菌絲在大米表面能均勻生長， 待10 天左右形成綠色孢子即可收獲。親米成熟接人生產(chǎn)米后也要經(jīng)過激烈振蕩才可放置恒溫培養(yǎng)， 生產(chǎn)米的孢子量要求每粒米300萬只以上。親米、生產(chǎn)米子孢子都需保存在 5 °C冰箱內(nèi)。 　　工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米 (指收獲后的孢瓶在10天以內(nèi)使用) 接人含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi)，28 °C 培養(yǎng) 50-60h當(dāng)pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0， 菌絲呈菊花團(tuán)狀，平均直徑在 100- 130μm， 每毫升的球數(shù)為 6萬 -8萬只， 沉降率在 85% 以上， 即可根據(jù)發(fā)酵罐球數(shù)控制在 8000-11000只/ml 范圍的要求， 計(jì)算移種體積， 然后接入發(fā)酵罐， 多余的種子液棄去。球狀菌以新鮮孢子為佳， 其生產(chǎn)水平優(yōu)于真空干燥的孢子，能使青霉素發(fā)酵單位的罐批差異減少。 　?。?）培養(yǎng)基成分的控制 　　a. 碳源 產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 進(jìn)行流加。 　　b. 氮源 氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補(bǔ)加無機(jī)氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。 　　c. 前體 生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素 G， 需在發(fā)酵液中加人前體。前體可用、苯乙酰胺， 一次加入量不大于0.1%， 并采用多次加入， 以防止前體對(duì)青霉素的毒害。 　　d. 無機(jī)鹽加人的無機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等， 且用量要適度。另外， 由于鐵離子對(duì)青霉菌有毒害作用， 必須嚴(yán)格控制鐵離子的濃度， 一般控制在30 μg/ml 。 　　（3）發(fā)酵培養(yǎng)的控制 　　a. 加糖控制 加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程中的 pH 值確定 ， Z好是根據(jù)排氣中CO2 量及 O2 量來控制， 一般在殘?zhí)墙抵?0.6% 左右， pH 值上升時(shí)開始加糖。 　　b. 補(bǔ)氮及加前體 補(bǔ)氮是指加硫酸銨、氨水或尿素， 使發(fā)酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%，補(bǔ)前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 0.05%-0.08% 。 　　c. pH 值控制 對(duì)pH 值的要求視不同菌種而異， 一般為 pH 6.4-6.8， 可以補(bǔ)加葡萄 糖來控制。目前一般采用加酸或加堿控制pH值。 d. 溫度控制 前期 2 5- 2 6 °C， 后期 23 °C， 以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。e. 溶解氧的控制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的30% 。通風(fēng)比一般為1 : 0. 8L/(L • min)， 攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。 　　f. 泡沫的控制 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫， 可以用天然油脂， 如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑 " 泡敵 " 來消泡， 應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入， 尤其在發(fā)酵前期不宜多用， 否則會(huì)影響菌體的呼吸代謝 　　g. 發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時(shí)間從發(fā)酵罐中取樣 ， 用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱" 鏡檢 "，根據(jù)" 鏡檢 "中菌絲形變化和代謝變化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度， 通過追加糖或補(bǔ)加前體等各種措施來延長發(fā)酵時(shí)間， 以獲得Z多青霉素。當(dāng)菌絲中空泡擴(kuò)大、增多及延伸， 并出現(xiàn)個(gè)別自溶細(xì)胞， 這表示菌絲趨向衰老， 青霉素分泌逐漸停止， 菌絲形態(tài)上即將進(jìn)入自溶期， 在此時(shí)期由于茵絲自溶， 游離氨釋放， pH 值上升， 導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量下降， 使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多， 并使發(fā)酵液變蒙古稠， 增加下一步提純時(shí)過濾的困難。因此， 生產(chǎn)上根據(jù)" 鏡檢 "判斷， 在自溶期即將來臨之際， 迅速停止發(fā)酵， 立刻放罐， 將發(fā)酵液迅速送往提煉工段。

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