一篇在線發表于《細胞》雜志的論文介紹了一項重要突破：來自韓國的研究團隊***在線粒體DNA中實現A堿基到G堿基的轉換，為基因編輯技術填補上一塊***關重要的拼圖，也帶來了治愈多種線粒體遺傳病的希望。

從上世紀60年代***發現***性內切酶，到1985年發明PCR技術，再到***近十年CRISPR技術誕生、用于活體生物的基因編輯，短短半個世紀，人類在一次又一次的突破中實現了操縱DNA能力的巨大飛躍。其中，CRISPR的出現更是讓科學家能高效編輯基因組中的致病突變，為眾多遺傳病提供全新的方案。

不過，還有一朵烏云長期籠罩在基因編輯領域的上空，這就是線粒體DNA的編輯。

作為參與能量代謝的重要細胞器，線粒體中也含有少量來自母系的DNA。如果這部分基因發生突變，則可能導致多種與代謝相關的遺傳疾病。

例如，Leber遺傳性視神經病變（LHON）可能導致患者失明，這種兇險的疾病就是由線粒體DNA的點突變導致的。線粒體DNA突變還可能導致某些線粒體腦肌病，患者的大腦遭受損傷，可能出現癲癇、精神行為異常等癥狀。平均每5000個人里，就有一個人患上線粒體點突變導致的遺傳病。

盡管基因編輯工具***近十年迎來爆發式發展，但面對線粒體遺傳病時，這些工具卻總是難以奏效。例如，當下***為盛行的CRISPR-Cas系統就因為向導RNA不能穿越線粒體膜，因而無法用于線粒體疾病。

線粒體DNA的編輯，可以說是基因編輯領域***后一塊未經涉足的土地，而這個難題也成為治愈多種遺傳疾病必須跨越的障礙。

2020年，一項***性的突破到來。Broad研究所的劉如謙教授團隊開發了一款名為DdCBE的基因編輯工具，可以直接修改雙鏈DNA上的堿基，實現從C堿基到T堿基的轉換，這也是科學家***在人體細胞中進行線粒體DNA的編輯。

不過，作為線粒體DNA編輯的開拓性成果，DaCBE也有不足之處：其只能高效地進行TC-TT序列的轉換，在90個已知的致病線粒體突變位點中，只有9個能得到修復。

而在這90個突變位點中，有多達39個都可以通過A-G堿基的轉換來修復。如果能找到實現A-G轉換的手段，那么包括上述兩種疾病在內，多種線粒體遺傳病都有望迎來治愈的方法。

在這項發表于《細胞》的***新研究中，來自韓國基礎科學研究所基因編輯中心的研究團隊終于完成了這項“不可能的任務”，他們開發出一款全新的基因編輯平臺，命名為轉錄激活因子樣效應物相關脫氫酶（transcription activator-like effector-linked deaminases，簡稱TALED）。

▲TALED編輯線粒體DNA的示意圖

論文***作者CHO Sung-Ik表示：“我們設計的新型堿基編輯器極大地拓展了線粒體DNA編輯的范圍，這不僅有助于構建疾病模型，還將幫助人們開發新療法。”

TALED到底是什么？接下來我們將看到，TALED由3個功能各異的主要部分組成，它們環環相扣、共同協作，***終完成這項基因編輯任務。

***個部分，可以看作TALED的向導。前面說到，常見的基因編輯系統無法進入線粒體。為了解決這個問題，TALED與劉如謙團隊開發的DaCBE一樣，使用了轉錄激活因子樣效應物（TALE）。作為一種DNA結合蛋白，TALE蛋白能夠靶向特異的DNA序列，其在線粒體靶向序列（MTS）的引導下進入線粒體，并且與特定的線粒體DNA序列結合。

到這里，TALED就被帶到了工作場所。在這里，輪到TALED的第二個部分登場。研究團隊需要找到合適的脫氫酶，在這里實現A-G堿基的轉換。為此，他們選擇是名為TadA8e的腺嘌呤脫氫酶，其由大腸桿菌的腺嘌呤脫氫酶改造而來。

這個選擇頗具創意，因為TadA8e被認為是一種專門對單鏈DNA起作用的蛋白，但在這里，它需要在線粒體的雙鏈DNA中進行堿基編輯。

這篇論文的通訊作者，基因編輯中心主任KIM Jin-Soo教授說：“沒有人想過用TadA8e在線粒體中進行堿基編輯，因為它被認為只對單鏈DNA起作用。正是這個跳出傳統框架的想法，幫助我們發明了TALED。”

而幫助TadA8e做到這一點的，是TALED的***后一個主要部分：胞嘧啶脫氫酶DddAtox。DddAtox使得雙鏈DNA可以短暫地解開，而TadA8e正是抓住了這個轉瞬即逝的時間窗口，在人類細胞的線粒體中高效催化A-G堿基的轉換，編輯頻率可高達49%。

▲TALED實現了A-G堿基的轉換

通過對TALED的調整，研究團隊分別開發出能同時實現A-G以及C-T堿基轉換的技術，以及僅進行A-G轉換的技術。

當然，作為一項開創性的技術，TALED仍有不***之處，例如在進行堿基編輯時，可能會造成與目標位點相鄰的核苷酸也發生轉換；此外，TALED是否會在哺乳動物細胞中產生脫靶效應也有待觀察。

但毫無疑問，TALED技術的出現讓我們又多了一種***潛力的基因編輯工具，展望這項技術的未來應用場景，研究團隊希望能提升TALED的編輯效率與特異性，***終能夠分別在胚胎、新生兒與成年患者體內修正致病的線粒體突變。我們期待，那些受困于線粒體遺傳病的人們終將迎來治愈的一刻。

RNA提取磁珠屬于納米生物磁珠的一種，主要作用是用于核酸提取過程中的RNA提取，粒徑分布在500nm左右，是洛陽吉恩特生物自主研發生產的高分子納米磁性微球，該磁珠懸浮時間長，磁響應時間迅速，對DNA甲基化過程中的提取環節提供良好的支持，可明顯縮短實驗時間，提高實驗效率，并在提取結果上保持穩定，配合核酸提取儀，更能實現快速的RNA提取。

哈佛大學的科學家已經造出了這種神奇的食品包裝涂層。在一項發表于《自然?食品》的研究中，作者展示了如何利用天然材料實現食品包裝的***。

目前的塑料食品包裝需要消耗大量石油，并且難以降解。因此，研究團隊希望開發出一款更具可持續性、可降解并且無毒性的替代材料。這項研究的Philip Demokritou教授說：“同時我們也在問自己，我們能不能設計出能延長生鮮食品銷售時間、減少食物浪費并且提升食品安全的新型包裝。”

這款新型材料的主體成分，是由普魯蘭多糖——一種由微生物天然發酵形成的多糖——構成的纖維結構。這種多糖被FDA認定為“通常被認為是安全的”（GRAS）成分。此外，纖維結構中還添加了天然抗jun成分，包括百里香精油、檸檬酸和乳酸鏈球菌肽。

相比于現有的食品膜，纖維結構材料的表面積/體積比更高，因此攜帶的成分可以更高效地發揮作用，以更低的成本解決病原體污染食品的問題。

為了讓材料附著在食物表面，研究團隊開發出一套高通量的噴涂設備：以水為溶劑，直接噴涂***新鮮食物的表面，形成纖維保護層。

▲這套設備能將涂層均勻噴涂***食品表面

盡管看起來只是涂了一層膜，但這層材料足夠結實，可以避免運輸途中的磕傷；同時，材料包含的抗菌成分可以抵御大腸桿菌、李斯特菌等常見病原體。

以牛油果為例，研究團隊檢驗了這種材料的效果。牛油果在運輸途中仍會持續成熟，并且可能腐爛，因此有利于看清食品的保存情況。

經過2~4分鐘的噴涂，牛油果被纖維涂層包裹。這時，牛油果的可銷售時間延長了50%。相比于對照組，它們的腐爛比例更低、菌群數量與質量損失更少。而去除這層材料也很容易，只要水洗20秒就可以沖去，在土壤中僅需3天也可以降解。

▲對照實驗展示了涂層良好的保鮮效果

Demokritou教授道：“我們提出的是一項可規模化的技術，它可以讓我們將生物聚合物轉變為能夠直接包裹食物的纖維。這將成為新一代更智能、綠色的食品包裝。”此外，研究團隊還通過實驗展示了大規模生產這款材料的潛力。

Demokritou教授說：“在過去五六十年間，我們已經向環境排放了600萬噸塑料垃圾。它們的降解十分緩慢，而降解產生的微小顆粒也會隨著飲用水、食物甚***是空氣進入我們體內。”而研究團隊制造的智能纖維材料能消除菌株，確保食物的安全。這款全新設計的材料，或許將改變現有的食物存儲模式，引領下一場***。

11月19日北京時間23:00（巴黎時間：17:00），歐洲分子生物學實驗室研究員Moritz Kueblbeck將于Genomeweb平臺在線分享“在CRISPR編輯的細胞系中使用數字PCR進行標記拷貝數評估”相關知識。

本網絡研討會將介紹如何使用dPCR快速定量CRISPR編輯的HeLa細胞中的綠色熒光蛋白拷貝數。討論還將介紹dPCR的工作原理和采集后的數據分析方法。

Moritz Kueblbeck在德國海德堡的癌癥研究ZX(DKFZ)做了八年的研究員。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的歐洲分子生物學實驗室,在不同實驗室的項目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用內源性的標記蛋白(在HeLa和U-2 OS細胞進行不同標簽的純合敲入)進行人類細胞系基因組編輯。

內容簡介

l  熒光蛋白或自標記是使用熒光顯微鏡研究活細胞中蛋白質動力學的寶貴工具。然而，定量成像需要目標蛋白(POI)的生理表達水平，特別是當需要研究POI的化學計量相互作用時。

l  CRISPR使研究人員能夠標記幾乎任何感興趣的目標基因，使其可以研究相應POI的生理表達水平。然而，正確編輯細胞克隆的產生和選擇——即標記等位基因的預期數量和缺乏額外的整合——需要對標記的拷貝數進行定量評估。

l  探討dPCR是一種快速、可靠的熒光標記CRISPR編輯細胞定量檢測方法。

注冊地址：https://event.on24.com/eventRegistration/EventLobbyServlet?target=reg20.jsp&partnerref=stilla&eventid=2111188&sessionid=1&key=2206BD6DA2548F0F9C46911E3A71DD

[主題]

    FluidFM：CRISPR基因編輯技術的新突破

[直播時間]

    2020年3月26日，16:00 - 17:00

[報告簡介]

    提高轉染物質導入細胞核的效率目前仍然是基因編輯中的一大挑戰。FluidFM 技術能夠將轉染物質直接注射到細胞核中，從根本上解決這一難題。這一技術對于極難轉染或原代的細胞系的基因編輯有著十分重要的意義。

    本次研討會是關于“提高CRISPR基因編輯效率的全新方法”的網絡研討會。向您展示如何通過直接向細胞核中導入轉染物質，從而解決細胞轉染效率低下的問題。

特別提示：本次研討會還包括在線的實驗演示！

[產品簡介]

    瑞士Cytosurge公司多功能單細胞顯微操作系統—FluidFM BOT，是將原子力系統、微流控系統、細胞培養系統為一體的單細胞操作系統。主要功能包括單細胞注射、單細胞提取以及單細胞分離。

    FluidFM BOT打開了傳統單細胞實驗手段無法觸及領域的大門。突破了單細胞研究、藥物開發、細胞系開發中的障礙，讓細胞膜不再成為阻礙單細胞研究的壁壘。

    多功能單細胞顯微操作系統FluidFM BOT濃縮了FluidFM科技的全部精華，尤其是在自動化程度和操作速度上的提高。它不僅保留了產品在生物學上的能力。更能夠將這些功能進行組合來創造更加GX、便捷全新試驗方法。

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[聯系方式]             

[主辦方]

       榮登封面的這項研究成果來自哈佛***神經科學家Joshua Sanes教授領銜的科學家團隊。研究人員采用高通量單細胞基因測序的方法，創建了靈長類動物的視網膜細胞型態分類圖譜，揭示為我們帶來敏銳視覺的細胞有哪些特殊的基因特征。這項研究同時為理解人類視覺在疾病情況下如何被破壞提供了重要的基礎。

      凹：讓我們看得清清楚楚明明白白真真切切

人類的視覺在哺乳動物中出類拔萃，比如我們能夠閱讀，分辨人臉。這些功能可不簡單，需要視覺能夠分辨極細微的差異，并能迅速對焦。高清視覺全得歸功于視網膜中間一個極小的特殊區域——***凹，也就是眼底黃斑的中心。凹的直徑不到1.5毫米，面積只占視網膜的不到1%，但大腦獲得的視覺信息卻有50%來自這里。

     凹的特殊，還不僅是因為視線的“焦點”落在此處提供清晰影像，要知道哺乳動物中只有部分靈長類生物進化出了這個結構，比如人類。

▲“那（fovea）是個稀罕物，豈是什么生物都能有的？”

      凹為人類提供了視力的同時，卻讓科學家在解決人類視覺疾病時面臨一個難題。就拿實驗“勞模”小鼠來說，雖然它們為人類的科學研究提供了無數疾病模型，但它們“鼠目寸光”，視網膜沒有***凹！這種 “先天缺陷”讓它們在視覺相關疾病的模型上幫不上什么忙。再加上***凹結構太微小了，過去科學家在靈長類動物上的研究也止于形態解剖學的描述。

     終，他們在凹和外周視網膜中均鑒定出了近70種不同類型的細胞，并且還知道了每一個類型的細胞表達哪些基因。

      詳盡的細胞分類圖譜給科學家們提供了許多過去不知道的信息。用Sanes教授的話說，“我們現在弄清楚了凹特別在哪里。”

▲凹的細胞和外周視網膜類型相似，但組成卻不同 

       盡管細胞類型九成相同，但***凹和外周視網膜的細胞類型組成不同。更關鍵的是，在同類型的細胞中，***凹處的細胞檢測到表達與外周不一樣的基因。非常有意思的是，這些基因的表達和***凹獨特的視覺信息處理極為相關，科學家們相信，可能這才是***凹功能特殊的原因。

       核酸提取產品對細胞篩選的方法已日漸成熟，原理是將包被一抗的磁珠與細胞表面對應的分子特異性結合，或者將包被二抗的磁珠與已經與細胞表面分子特異性結合的一抗結合。核酸提取磁珠攜帶與之結合的細胞吸附與分離柱或試管上，實現陽性細胞或陰性細胞的分離。洛陽吉恩特生物自主研發生產了各類核酸提取磁珠，可以實現穩定的實驗結果。

ETAS軟件產品：RTA_用于ECU代碼開發

RTA產品系列包括RTA-OSEK， RTA-OS，RTA-RTE， RTA-TRACE以及相關的附加軟件。它們組成了一個完整的開發工具包，用于ECU代碼開發。

RTA-OSEK

RTA-OSEK可提供符合AUTOSAR-OS V1.0（SC-1）和OSEK-OS V2.2.3要求的解決方案，由以下工具及模塊組成：

Planner

建造應用程序的時間模型并采用先進的時限單調性分析（Deadline Monotonic Analysis）法證明在運行時能夠滿足其所有的性能約束，并將解決問題所需的成本控制在Z小范圍之內。  

Builder

自動為應用程序中的各個任務和ISR（中斷服務程序）生成經過優化的頭文件以及OS數據結構。利用靜態配置，可生成內存使用量Z小的數據結構，并可使用快速API調用來減小CPU的占用。

產品軟件模塊

在采用AUTOSAR-OS和OSEK-OS標準方面處于行業lingxian地位。它支持很多微控制器及編譯器，各個端口都單獨通過了認證，確保了它們的兼容性。它還符合MISRA C標準的要求，確保可安全地進行嵌入式操作。 

RTA-OSEK可生成所有所需的測量模塊接口配置，使用戶可通過RTA-TRACE觀察應用程序的運行情況。 

RTA-OS3.0

RTA-OS3.0是一種實時操作系統，其適用于汽車ECU設計所有領域的應用。它同時滿足AUTOSAR R3.0 OS以及OSEK/VDX OS V2.2.3標準，且與MISRA C完全兼容。

RTA-RTE

RTA-RTE3.0是一種成熟且已量產的高質量AUTOSAR運行環境（RTE）生成器，它符合AUTOSAR Release 3.0。

RTA-TRACE

RTA-TRACE通過以下功能提高調試速度：  

時間跟蹤

實時觀察應用程序的運行情況，與軟件邏輯分析器的功能完全相同。

統計插入

自動計算系統中每個任務執行時間的各種統計數據。

ECU連接

設備驅動器和DLL可將ECU中的數據傳輸到RTA-TRACE PC、CAN、調試器及串行聯接中。ECU連接端口包使用戶可根據需要創建定制式的連接。

RTA-TCEL

RTA-TCEL提供了一種使用ES580通過CAN總線從目標ECU向電腦主機傳輸數據的方法。

RTA-OSEK

RTA-OSEK具有一個適用于汽車ECU設計所有領域的生產型實時操作系統。它同時采用了 AUTOSAR-OS SC1和OSEK/VDX OS V2.2.3標準，并完全符合MISRA C的要求。它具有一個尺寸極小而且運行速度極快的內核，該內核適用于20多種微控制器。RTA-OSEK還結合了可用于對操作系統進行配置和分析的Planner和Builder工具。

Planner工具可針對應用程序的實時時限建立模型并可提前預測該應用程序的實時運行情況。Builder工具可用來生成該應用程序的優化數據結構和代碼。RTA-OSEK部件庫具有用于RTA-TRACE的可配置測量儀器。這樣，用戶便可使用功能強大且GX的開發程序來進行實時應用程序的開發。

RTA-OSEK 具有系統資源占用低和先進的時間安排控制功能等特性，是動力總成系統及底盤電子應用中的理想產品。車身電子模塊的設計者們非常看重這種極低的內存使用量及堆棧優化功能。同時，RTA-OSEK可進行廣泛的一致性檢查，并可自動生成設計檢查表和模板文件，因而十分有助于ECU軟件開發者們的開發工作。
RTA-OSEK在PC端口上也適用。這為AUTOSAR的虛擬開發和基于ECU應用軟件的OSEC提供支持。例如，您可在您的電腦而不是產品硬件上進行開發。

功能一覽:

◆采用AUTOSAR-OS SC1標準  

◆通過OSEK/VDX OS標準所有等級要求的認證

◆符合MISRA C要求  

◆支持8、16及32位微控制器

◆支持在標準Windows電腦上虛擬ECU的開發

◆低CPU占用

◆內存要求小

◆系統時間可調度性（schedulability）、靈敏度、堆棧容量及Z小CPU速度分析

◆可自動生成優化的數據結構  

◆方便使用的圖形界面 

◆獨特的單堆棧實現（ZL申請中），通常可節省50-80%的應用程序存儲空間

RTA-OS

RTA-OS3.0是一種實時操作系統，其適用于汽車ECU設計所有領域的應用。它同時滿足AUTOSAR R3.0 OS以及OSEK/VDX OS V2.2.3標準，且與MISRA C完全兼容。

       RTA-OS3.0采用了行業內lingxian的RTA-OSEK嵌入式技術。秉承minimum的運行時間耗費以及靈活配置的原則，RTA-OS3.0能為您的應用軟件生成Z優化的OS內核。由于AUTOSAR OS具備充分的接口，包括時序和存儲器保護，所以OS配置和生成工具就必須將OS對整個系統所產生的影響Z小化。通過其創新的OS生成方式，RTA-OS3.0可以非常簡單地接至通用的汽車微控制器和編譯器上。ETAS對汽車應用軟件的嵌入式軟件的需求有著深入的了解，而RTA-OS3.0就是專為新一代的AUTOSAR系統而開發的。

RTA-OS3.0可以與其他ETAS的軟件工程工具進行無縫整合；它與RTA-RTE（ETAS提供的AUTOSAR運行時環境生成器）完全兼容。此外，RTA-OS3.0還完全支持RTA-TRACE；這就讓您可以使用RTA-TRACE強大的可視化能力來對您應用軟件的性能進行分析和測量。

為了支持AUTOSAR應用軟件的虛擬開發，RTA-OS3.0將在一臺裝有Windows的個人電腦上進行編譯和執行的能力作為標準。這一強大的特性使您可以看到您應用軟件中新想法的結果，而不受ECU目標硬件的影響。RTA-OS3.0可以安裝在您桌面上開始創建AUTOSAR應用程序所需的所有開發工具。

功能概覽：

◆AUTOSAR R3.0 OS標準的工具

◆OSEK/VDX OS標準的所有匹配等級的認證工具

◆與MISRA C相匹配的工具

◆支持8位、16位以及32位的微控制器

◆支持基于標準Windows電腦的虛擬ECU開發

◆很少的CPU開銷

◆需要很少的內存

◆分析系統的可調度性、敏感性、堆棧大小以及minimumCPU運算速度

◆自動生成Z優數據結構

◆圖形接口易于使用

◆獨特的單堆棧實現工具，其通過適合的OS配置，一般可節省50%到80%的應用軟件占用空間

RTA-OSEK

AUTOSAR運行環境（RTE）實現了應用軟件組件的通訊基礎構架、應用軟件組件的實時調度以及應用軟件組件與基本軟件模塊之間的接口。RTA-RTE3.0是一種成熟且已量產的高質量AUTOSAR運行環境（RTE）生成器，它符合AUTOSAR Release 3.0。它是一種基于個人電腦的命令行工具，可以簡單的集成到各種建立環境中，以生成與AUTOSAR兼容的RTE。RTA-RTE產品線還包括了符合AUTOSAR Release 2.0的RTA-RTE2.0。RTA-RTE3.0幫助客戶解決許多涉及RTE生成過程的問題，例如，提供輸入XML配置信息的驗證、生成操作系統（OS）配置信息以及提供簡單的查錯能力。RTA-RTE3.0的另一個重要特征是，系統能夠在可能的時候對生成RTE的資源使用量進行優化，便于用戶作決定：應該優化代碼大小（內存）還是該優化運行時間（CPU占用量）。RTA-RTE3.0生成的RTE獨立于編譯器和目標，使其可以在廣泛的ECU平臺上使用。

功能概覽:

◆成熟的RTE生成工具

◆符合AUTOSAR Release 3.0

◆ 所生成的RTE對MISRA C完全兼容

◆與 RTA-OSEK 以及RTA-OS3.0的無縫整合

◆可以針對內存或CPU占用率，對RTE資源的使用量進行優化

◆可以非常簡便得與各種建立環境集成

◆驗證輸入數據（XML）的正確性和一致性

◆既支持AUTOSAR合同階段，也支持RTE生成階段

◆輸出OS配置，使RTE和OS的整合變得簡單

◆獨立于編譯器和目標的RTE可以在廣泛的ECU平臺上使用

◆支持用C或C++編寫的SWCs，這些語言可作為源代碼或者是主體代碼

◆通過使用虛擬功能總線（VFB）來進行跟蹤，使查錯變得很簡單

◆ 生成的RTE與OSEK 2.2.3、AUTOSAR兼容

◆SC1及ERCOSEK V4.3操作系統

RTA-TRACE

LiveDevices軟件邏輯分析儀使用戶能夠：

◆通過復雜應用程序運行情況的圖形顯示，加快調試過程。

◆借助于內部操作系統（OS）事件的可視化來加強對應用程序的控制并提高可信度。

◆借助于報告模塊，可輕松形成系統特性文檔。

◆通過詳細的統計分析，改善系統及模塊的驗證。

◆OS儀器包可靈活用于任何基于OSEK-OS、非OSEK-OS或調度程序的應用程序。

◆支持多種標準ECU連接及靈活的ECU目標連接組件，可方便地集成到任何開發環境中。 

RTA-TRACE是LiveDevices的一種新型跟蹤工具，使實時嵌入式軟件的開發更加簡單明了。通過RTA-TRACE，用戶可查看某個系統中復雜的實時交互作用， 從而更快地發現問題并加快軟件開發速度。RTA-TRACE可向開發者提供一個觀察應用程序運行情況的窗口。開發者可從正在運行的應用程序中捕獲跟蹤數據，以清晰的格式將其顯示出來，再快速對其進行解釋，從而可快速識別出缺陷并加以消除。

借助于RTA-TRACE，開發者可在與應用程序開發所采用的相同的抽象層上進行開發工作；RTA-TRACE 可顯示由開發者創建的應用程序的特征數據 ，與使用C語言調試器作為基于OS的應用程序代碼調試工具相比，這種方法向前邁進了一大步。RTA-TRACE可幫助用戶快速而GX地解決以下問題： 

◆任務/中斷程序的Z短、Z長及平均執行時間是多少？

◆任務/中斷信號激活速率的抖動（jitter）是什么?

◆在運行時會出現什么樣的搶占（preemption）模式？

◆源/旗語（resource/semaphore）的使用是否會引起性能故障？

◆總CPU利用率是多少？

RTA-TRACE工具可在PC上運行并顯示從目標ECU上捕獲的跟蹤數據。應用程序中的相關測量接口配置（可記錄OS及用戶級事件數據）可將跟蹤數據存儲在目標ECU的跟蹤緩沖器中。使用OS工具包（RTA-TRACE的組成部分），用戶可配置市場上的各種OSEK-OS (LiveDevices的另一種服務)。此外，該工具包還可用于向任何自主開發的操作系統或循環應用增加測量設備，這樣便可通過RTA-TRACE工具捕獲并分析跟蹤數據。

跟蹤數據通過ECU連接傳輸給主機系統。RTA-TRACE可用串行和基于調試器的方法進行ECU連接（可提供可選附加產品即基于CAN總線的ECU連接，RTA-TCEL）。RTA-TRACE 中的ECU連接端口組件使用戶可為其它物理層傳輸路徑開發出更多的ECU連接。

RTA-TCEL

       RTA-TCEL（Trace CAN ECU Link）是RTA-TRACE調試和分析工具的一個附件產品。RTA-TCEL提供了一種使用ES580通過CAN總線從目標ECU向電腦主機傳輸數據的方法。
       RTA-TCEL支持附帶TouCAN控制器的MPC56x。同時，它還提供一個全功能接口工具包，以滿足開發人員連接RTA-TCEL和其它微處理器及CAN控制器的需求。
       RTA-TCEL可被用于具有通過控制器系統中單獨的CAN通道來通信；也可以與標定用的CAN總線進行共享來發送跟蹤數據（文檔中提供示意圖來解釋如何和現有的CAN網絡軟件一起使用RTA-TCEL）。
       功能概覽:
       ◆從ECU到主機的高帶寬跟蹤數據傳輸
       ◆獨立或并行的標定CAN通訊流量
       ◆支持ES580 CAN總線以及LIN總線PCMCIA卡

CRISPR-Cas9技術徹底改變了基礎生物研究和應用生物技術的許多領域。但在臨床基因治療實施中脫靶效應的檢測仍然存在難題。德國漢堡大學-艾本多夫醫學中心（UKE）干細胞移植、細胞和基因治療研究所的學者們近日在知名雜志《Molecular Therapy》上發表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了稱為LATE（長期不良治療效果鑒定檢測）的新型檢測方法，該方法使用Stilla naica?微滴芯片數字PCR系統檢測低頻的脫靶事件，且有助于分析Cas9脫靶切割效應的影響，并可在單細胞層面進行評估。

為了證明LATE方法有助于檢測Cas9脫靶切割后的功能影響，研究人員進行了小規模的原理驗證實驗：明星基因TP53基因敲除后會導致細胞表現出相對生長優勢，這是主要的致瘤性標志之一，因此可以作為驗證“LATE”檢測脫靶能力的指示。本文選取TP53進行CRISPR靶向實驗，并轉染到有限稀釋后的原代人類新生兒包皮成纖維NUFF細胞中，通過“LATE”方法重復檢測到低頻(<0.5%)生長促進事件，這一結果證明了即使在低起始細胞數的情況下，LATE檢測也具有高靈敏度，并且可以對單個細胞進行評估。

圖 1. LATE檢測原理

LATE檢測的原理包括 (1)用編碼熒光蛋白、設計的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒載體轉導原代人類新生兒包皮成纖維細胞 (NUFF)，(2) 使用流式細胞術分析轉導率并連續監控長達10周，(3)讀取結果，隨著轉導細胞數量的增加，作為基因組編輯效應的細胞獲得生長優勢

在這一過程中，“LATE”讀取到的陽性結果（獲得生長優勢的細胞）會不會由TP53以外的基因被“脫靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突變，例如插入誘變從而導致細胞獲得生長優勢呢?為了研究“LATE”檢測的陽性結果與TP53插入缺失之間的聯系，研究人員設計了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）實驗，即Drop-Off分析方法，該方法可以量化gRNA結合位點以及脫靶位點的插入缺失頻率。

圖2. NUFF細胞獲得的生長優勢與TP53中的插入/缺失頻率相關 (A)TP53外顯子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX標記探針的示意圖。(B) TP53插入/缺失頻率，數據由GFR-dPCR測量獲得。(C) 脫靶TP53插入/缺失頻率，由GEF-dPCR測量獲得。

對于TP53 gRNA結合位點的檢測，GEF-dPCR使用兩個雙標記水解探針，一個HEX標記探針與遠離gRNA識別序列的區域結合，易發生插入缺失的位點設計FAM標記的探針（圖2A）。

文中使用Stilla naica?微滴芯片數字PCR系統進行GFR-dPCR方法檢測，實驗方法詳見原文第12頁。

隨后進行Stilla naica?微滴芯片數字PCR系統檢測，結果顯示隨著時間的推移，TP53插入缺失的頻率隨之增加，轉導后第7天插入缺失率為1%–22%，在52天后達到44%–85%的峰值，該變化趨勢和細胞獲得生長優勢的趨勢一致。（圖2B）

研究人員還對TP53脫靶位點的插入缺失頻率進行了檢測（圖2C）。上述dPCR檢測結果也與NGS測序方法和RGB熒光標記方法一致，從而說明“LATE”能夠檢測TP53介導的gRNA的不良脫靶效應，但這些gRNA并沒有被常用的在線預測工具標記為“危險信號”。

隨后，作者還驗證了“LATE”可用于任何類型的設計核酸酶以及不同的CRISPR/Cas變體，并且可以擴展用于其他細胞類型，尤其是高度相關的原代hMSC。因此，“LATE”實驗方案可用于驗證特定細胞類型中特定設計核酸酶的脫靶效應的影響。

圖3：LATE檢測可應用于hMSCs和h-TERT永生化細胞

綜上，“LATE”可以作為一種簡單、快速和經濟的技術手段，用來評估CRISPR/Cas系統帶來的生理“副作用”影響，輔助臨床前的安全性研究，是對基于NGS的全基因組脫靶檢測方法的有效補充，特別是補充了流式和數字PCR的檢測結果。

期刊介紹：《Molecular Therapy》是美國基因治療學會(ASGT)的月刊，是基因轉導、載體開發與設計、干細胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的開發、細胞療法、疫苗開發、臨床前目標驗證、安全性/有效性研究和臨床試驗等領域的領先期刊。《Molecular Therapy》致力于促進遺傳學、醫學和生物技術的科學發展，影響因子為6.698。

基因工程細胞的同質性對于很多應用都是必要條件，例如細胞株開發、基因ZL、組織工程以及細胞ZL與再生醫學。CRISPR/Cas9基因編輯存在脫靶等情況，無法直接得到均質的細胞，因此需要開展單細胞克隆，之后才能用于臨床。

CloneSelect單細胞分離系統（CloneSelect Single Cell Printer）采用類似噴墨打印的技術，柔和地產生包裹細胞的液滴無接觸地直接分配到微孔板中（圖1）。同時，該系統借助智能圖像分析，確認細胞數目，分析細胞的形態（大小和圓度）及熒光強度，聯動的真空裝置將不符合要求的液滴（如空液滴或者含多個細胞的液滴）直接吸走，而符合要求的細胞液滴則分配至微孔板，從而實現對單個細胞的分選和接種。單細胞分離系統是一種可比移液器操作的柔和的單細胞分離技術，而流式分選由于高的液體剪切力和電壓的影響，會降低敏感細胞和部分受損細胞（如電轉后的細胞）的成克隆率，因此單細胞分離系統更適用于基因工程細胞的克隆，維持細胞活力，并提供直接的單克隆性圖像證據。

圖1：CloneSelect f.sight單細胞分離系統

最近發表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9對間充質干細胞（MSC）開展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整個實驗流程起始于轉染，接著用CloneSelect f.sight單細胞分離系統開展單細胞克隆，隨后在DNA、RNA以及蛋白質水平開展分析，ZH開展細胞功能分析（圖2）。

圖2：基因編輯間充質干細胞的單細胞克隆及分析流程。（圖片來源：文獻1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除質粒中加入了GFP基因，轉染間充質干細胞后，用具備熒光分選功能的CloneSelect f.sight系統分選出轉染成功的單細胞。系統可設定細胞直徑、圓度和熒光強度等指標，分選出單個活細胞并接種至微孔板。圖3為系統分選基因編輯的間充質干細胞的5張連續的圖像。通過瀏覽單細胞分離過程中記錄的5張連續的圖像，作者統計單細胞接種的成功率為93.9±2.7%（n=451），即僅有~6%的孔為多細胞孔，或空孔或無法確認（圖4）。這一結果表明f.sight單細胞分離系統可以準確地識別細胞并成功將其接種至微孔內。

圖3：CloneSelect f.sight系統分選間充質干細胞時采集的5張連續圖像，可用于證明單克隆性。（圖片來源：文獻¹）。

除了帶GFP的基因敲除質粒外，作者還將pmaxGFP質粒轉染至間充質干細胞作為對照用于評估單細胞分離效率和克隆率。此外，作者轉染了多個不同的基因敲除質粒。雖然不同的質粒因為大小不同而呈現各異的轉染效率，但是成克隆率都達到了30%。此外，作者還發現轉染質粒的間充質干細胞（31.3±8%）和未轉染的間充質干細胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差異較小，這也表明f.sight的單細胞分選過程柔和，因此產生的系統偏差較小（圖4）。

圖4：CloneSelect f.sight單細胞分離系統的高接種效率（左）和高成克隆率（右）。（圖片來源：文獻¹）。

接著作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分別從DNA、RNA和蛋白質水平對基因編輯后的間充質單細胞開展分析。ZH作者選出一株雙等位基因敲除的間充質干細胞（g23d）檢測其成骨分化的能力，并以未編輯的MSC為對照開展平行實驗。細胞轉移到成骨分化培養基后，分別在第7天、14天和21天用茜素紅染色。在第14天，細胞失去細長的成纖維細胞樣形態，開始呈現出成骨細胞樣的形態，然后在第21天開始出現鈣沉積，發展過程與親本的MSC對照類似（圖5）。這表明基因編輯后的MSC其成骨分化能力并沒有因為基因編輯和篩選過程而受到影響。

圖5：RANKL基因敲除的間充質干細胞（g23d）和親本間充質干細胞的培養和成骨分化。（圖片來源：文獻1）。

在這個研究中，作者搭建了一整套實驗流程，起始于CRISPR/Cas9基因編輯，單細胞克隆以及DNA、RNA和蛋白質各個水平的分析和細胞功能測試。實驗流程中采用CloneSelect f.sight單細胞分離系統成功GX地分選出基因編輯后帶GFP的間充質干細胞。單細胞接種效率高達93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高達31.3% (±8%)。相比傳統的有限稀釋法和流式分選，CloneSelect單細胞分離系統具有GX率，高活率，操作簡單，單克隆性證據充分等優勢，是基因工程細胞克隆的理想工具。

基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒有結束，你需要驗證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數字PCR技術來檢測基因編輯嗎？快來參加本次深藍云直播課堂吧！

近年來，隨著法規的推動，制藥人士對于分析方法生命周期的關注度越來越高。USP通則<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，ICH Q14<分析方法開發>也已結束第三階段公開征求意見階段。ICH Q14指出，在分析方法開發時，可以使用基礎（即傳統型）方式或加強型方式。本文案例即使用加強型方式 — Fusion QbD軟件輔助生物藥分析方法開發。

摘要 

生物藥分析部門花費了大量時間開發耐用性好的分析方法，以保證原料藥和成品是純的，穩定的。為了快速將產品應用到患者身上，研發組織不斷地加快方法開發流程。提高分析方法開發效率的一個方法就是使用自動篩選和自動方法優化工具。

Fusion QbD軟件可支持色譜不同分離模式的自動篩選流程。Fusion允許客戶輸入與分離模式相關的幾個因素進行研究。然后基于統計學設計實驗以評估這些因素的影響。設計好的DoE實驗可導入Empower，并自動在Empower中創建儀器方法和樣品組，減少方法開發過程中大量的人工工作量。Empower運行樣品后，結果再一鍵導入Fusion中做建模分析，評估各色譜參數。

Fusion-Empower工作流程 

在Fusion QbD中生成用戶自定義考察因素的DoE實驗設計。Fusion將儀器方法寫入到Empower中，處理后的樣品結果再導入Fusion中分析，得到更優的色譜條件。

圖1.  Fusion Empower工作流程

案例1- WCX模式方法開發

• Fusion QbD自動篩選和自動優化；

• 通過Fusion產生69個儀器方法和樣品組，并導入到Empower3； 

• 5個小時人工，120小時儀器運行時間；

• DoE實驗考察因素：pH、梯度時間、流動相組成、有機添加物、鹽濃度和柱溫；

• QbD開發的分析方法結果顯示：主峰峰形改善，酸性系列峰和堿性系列峰的分離度都提高了；

• 圖2為QbD開發好的分析方法和之前傳統方式開發了5個月的方法色譜對比圖：

圖2. WCX 液相分離模式（A. 傳統方式開發的分析方法色譜圖 ；B. Fusion QbD開發的色譜圖，顯示酸性系列峰和堿性系列峰的分離度都得到提高）。

案例1 - 疊加圖

將Empower結果導入到Fusion中，產生WCX HPLC疊加圖。基于客戶定義的方法性能指標，白色區域是可接受性能區域，有顏色的區域是不滿足性能要求的區域。

圖3. 疊加圖顯示白色區域為滿足性能要求的可接受性能區域（左圖：鹽濃度vs梯度時間。右圖：鹽濃度vs. pH）。

案例2 - HILIC方法開發 — Fusion QbD篩選

• Fusion QbD產生的38個儀器方法導入到Empower；

• 2個小時人工，15個小時儀器運行時間；

• DoE實驗考察的因素：pH、柱溫、梯度時間；

• 得到的分析方法顯示蛋白1和蛋白2的分離度提高，兩個蛋白的拖尾因子降低。

圖4. HILIC液相分離模式（A. 傳統方法開發的分析方法色譜圖；B. Fusion QbD開發的分析方法色譜圖，顯示蛋白1和蛋白2的分離度提高，拖尾因子降低）。

 結論 

Fusion QbD成功用于生物藥的方法開發，首先生成HILIC和陽離子交換模式的DoE實驗設計。然后使用Fusion中的導出功能，在Empower中自動創建DoE設計好的儀器方法和樣品組。通過自動篩選功能，HILIC方法實現了提高兩個蛋白峰的分離度目標，陽離子交換方法實現了分離峰的數量和分離度的提高目標。在Empower3中處理好的結果導入到Fusion，經過統計和建模分析，得到了各個參數的操作空間(MODR)。使用Fusion QbD做方法開發節約的人工，大約為2.5個人工(FTE)一個月的工作時間。