實驗室細胞培養板步驟

　　1、細胞復蘇

　　將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中，加入37℃預熱的DMEM培養基中(其中胎牛血清約為10%)，輕輕吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

　　加入DMEM培養基清洗，棄上清液。加入DMEM培養基，輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，接種于培養皿/瓶中，在含5%  CO2的細胞培養箱中培養。

　　2、細胞傳代

　　當細胞密度達到80%~90%(過早產量不足，過晚細胞狀態不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養，一般1:3至1:5細胞一代，即從細胞接種到分離再培養的一段時間，非細胞有絲分裂次數)時，去掉培養基，用1X  PBS清洗2次。

　　加入胰蛋白酶(注意：消化液的量以蓋住細胞，消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度)進行消化，放入細胞培養箱中約2-3min。

　　加入適量DMEM培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM培養基清洗，棄上清液。

　　加入DMEM培養基，輕輕吹打混勻，吸取10微升進行計數，然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養箱繼續培養。

　　3、細胞凍存

　　當細胞密度達到80%~90%時，去掉培養基，用1X   PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化，放入細胞培養箱中約2-3min。加入DMEM培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM培養基清洗，棄上清液。加入lml凍存液(90%胎牛血清，10%DMSO。   一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養，另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護細胞)，放入凍存管內(管內有異丙醇，以溫度降低的速度)，立即放入4℃冰箱中凍存30min，然后放入-20℃冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內過夜。

　　第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

　　細胞凍存和復蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑，會導致細胞內冰晶的產生，從而使細胞產生內源性的機械損傷，引起細胞內環境滲透壓，PH，電解質等的改變，進而促使細胞死亡。

　　4、注意事項

　　(1)預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱;

　　(2)用75%酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手;

　　(3)正確擺放使用的器械：足夠的操作空間，不僅便于操作而且減少污染;

　　(4)點燃酒精燈：注意火焰不能太小;

　　(5)嚴格的無菌操作;

　　(6)貼壁細胞消化適度：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化;

　　(7)傳代細胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次只進行一種細胞的操作，每種細胞使用一套器材。避免交叉感染;

　　(8)傳代細胞瓶口每次打開或者關閉都需要在酒精燈上消毒。

　　實驗室細胞培養板步驟，我司由具有行業背景和豐富市場經驗的業人士組成，于為生命科學研究域提供產品，為廣大科研工作者提供服務。   既能滿足研發類客戶對產品種類、包裝的特殊要求，也能滿足生產型企業從小試、中試到規模化生產各個階段的綜合需求。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創美好的未來。