在非小細胞肺癌(NSCLC)靶向治療過程中，有可能會出現獲得性耐藥的問題。雖然目前已經發現了許多獲得性耐藥的驅動因素，但在治療過程中導致腫瘤進化的潛在分子機制還不完全了解，治療在多大程度上通過促進突變過程積極推動腫瘤的發展尚不明確。因此來自美國馬薩諸塞州總醫院的Hideko Isozaki和Ammal Abbasi等科學家發表了一篇名為《APOBEC3A drives acquired resistance to targeted therapies in non-small cell lung cancer》的文章，文中作者研究了在NSCLC靶向治療期間，是否有特定的突變機制驅動肺癌的基因組進化。結果表明靶向治療誘導胞苷脫氨酶APOBEC3A (A3A)突變可能促進非小細胞肺癌獲得性耐藥的發展。

       作者在研究中發現，臨床常用的肺癌靶向治療誘導A3A的表達，導致耐藥癌細胞持續發生突變。誘導A3A可以促進了藥物治療細胞中雙鏈DNA斷裂(DSBs) 的形成，從而導致耐藥細胞進化過程中的染色體不穩定性，如拷貝數改變和結構變異。通過基因缺失或RNAi介導來預治療誘導的A3A突變可以延緩耐藥的出現。因此，靶向治療誘導A3A突變可能促進非小細胞肺癌獲得性耐藥的發展。A3A的表達或酶活性可能是一種潛在的治療策略，以預防或延遲獲得性耐藥的肺癌靶向治療。因此靶向治療誘導A3A突變可能促進非小細胞肺癌獲得性耐藥的發展。 A3A的表達或酶活性可能是一種潛在的治療策略，以預防或延遲獲得性耐藥的肺癌靶向治療。

       在DNA雙鏈損傷形成時,H2AX的Ser139 位點會被迅速磷酸化,從而形成γH2AX，γH2AX可以作為雙鏈修復的標志物。文章中作者通過免疫熒光技術，利用ECHO Revolve正倒置一體熒光顯微鏡進行免疫熒光觀察。在奧希替尼治療2周后，我們觀察到PC9細胞中組蛋白變體H2AX的Ser139磷酸化水平升高（圖1），說明TKI誘導的A3A突變導致基因組不穩定，促進耐藥克隆的進化。將γH2AX映射到TKI處理的PC9細胞的細胞周期分布上顯示，γH2AX最顯著地定位于一個恢復細胞分裂并處于G2期的細胞亞群（圖2），因此，TKI治療誘導增殖耐藥細胞中A3A催化的基因組損傷。

▲圖1：用1 μM奧希替尼處理PC9細胞0或14天，用γH2AX染色以量化DNA損傷。NT，沒有處理；比例尺= 70μm。

▲圖2：左圖是用1 μM奧希替尼處理PC9細胞14天，用EdU/DAPI染色以分辨細胞周期，代表G1、S、G2細胞;比例尺= 10 μm。右圖是EdU細胞周期試驗的散點圖，用γH2AX定量DNA損傷。NT：未處理。

       
      作者的研究結果表明，TKI治療后APOBEC突變信號的獲取可能指示了耐藥克隆的進化路徑，并提供了一種新的機制，通過該機制，靶向治療可能在治療期間無意中增加了癌細胞的適應性突變。因此，阻止A3A的表達或酶活性可能是一種潛在的治療策略，以預防或延遲獲得性耐藥的肺癌靶向治療。

參考文獻：H Isozaki, Abbasi A , Nikpour N , et al. APOBEC3A drives acquired resistance to targeted therapies in non-small cell lung cancer. 2021.

DOI:10.1101/2021.01.20.426852

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循環腫瘤DNA（ctDNA）是一類具備廣泛應用前景的腫瘤標志物，可用于腫瘤發展及預后狀態的無創測定。現有的ctDNA檢測方法要根據每位癌癥患者的情況來制定繁瑣的檢測步驟，且敏感度低，難以適用于廣泛的臨床應用。近期在Nature Medicine上發表的一篇文章中1，研究人員介紹了一種全新的ctDNA檢測技術：癌癥個體化深度測序分析方法（CAPP-Seq，cancer personalized profiling by deep sequencing）。該方法利用定制化的NimbleGen SeqCap EZ Choice Library作為”篩選器” (selector)對樣本進行靶向捕獲后再進行深度測序，其對非小細胞肺癌（NSCLC）的ctDNA檢測結果靈敏度高，特異性強且經濟可行。

研究者從腫瘤基因突變數據庫（COSMIC）等來源找出與NSCLC復發突變相關的外顯子，再對來自腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas)數據庫的407位NSCLC患者全基因組測序結果進行篩選，并應用迭代算法使篩選出的區域在充分覆蓋每個樣本的錯義突變的同時盡可能的精簡。由于部分NSCLC有ALK、ROS1、RET相關的重排，因此研究者也將這些基因中復發突變的外顯子或內含子一并包含在目標區域內。羅氏NimbleGen根據以上區域定制了NimbleGen SeqCap EZ Choice Library靶向序列捕獲產品作為本次CAPP-Seq的”篩選器”，包含了139個相關基因的521個外顯子和13個內含子，共約125kb。NimbleGen”篩選器”有效的把測序區段濃縮到整個基因組大小的0.004%， 使得后續超高深度測序得以實現。

研究者還在不同階段的非小細胞肺癌（NSCLC）中對CAPP-Seq進行了驗證，發現II-IV期的NSCLC中檢測敏感性為，I期的NSCLC中敏感性為50%，而且在各期肺癌中的特異性均在96%，甚至ctDNA比例低至約0.02%的時候也還能夠被CAPP-Seq檢測到.II-IV期和所有分期的肺癌樣本中，根據ROC曲線計算出的AUC值分別為0.99和0.95，足以見得CAPP-Seq檢測的威力

研究者還發現，除去兩例I期樣本腫瘤大小明顯高于其ctDNA值所對應的大小外，用CAPP-Seq測定的ctDNA水平和腫瘤大小(用CT和PET評估) 之間存在顯著相關性（p＝0.0002，R2=0.89）。后續研究發現， ctDNA水平隨著病程進展和相應的ZL也在不斷的變化。研究者對于7例陽性和3例陰性樣本進行了腫瘤樣本（侵入性活檢）和血液樣本（非侵入性CAPP－Seq檢測）的篩查和基因型檢測對比， 結果發現CAPP－Seq能夠準確測定肺癌的基因型，其檢測效能與作為金標準的腫瘤活檢相比毫不遜色。

雖然本研究主要是基于肺癌， 但研究人員認為，CAPP-Seq法將會廣泛應用于臨床，檢測多種類型的惡性腫瘤，促進個性化癌癥ZL的發展。

擔當CAPP-Seq這一新方法中舉足輕重的“篩選器”重任的NimbleGen SeqCap EZ Choice Library因其靈活的個性化定制和GX的靶向捕獲能力，使得對于不同腫瘤特異性的ctDNA的捕獲富集成為可能，成為CAPP-Seq進軍臨床的助推器。基于靶向富集和高通量測序技術的CAPP-Seq是否能成為ctDNA檢測的金標準， 讓我們拭目以待吧！

1. Newman A M, Bratman S V, To J, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J]. Nature medicine, 2014.

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