ROX是一種廣泛使用的惰性熒光染料，通常添加到qPCR反應液中以校正熒光信號。然而，隨著熒光技術在儀器中的發展，比如在Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統，為了標準化而單獨使用染料的步驟已不再需要。當實時熒光定量PCR系統首次引入市場時，許多產品使用固定光源和檢測系統對96孔整板進行同時成像，導致熱塊中每個孔的光路不同（圖1）。光程差異將導致每個孔的JD熒光測量值發生變化，這取決于它們在板上的位置。例如，具有較短光程的孔可能比具有較長光程的孔具有更高的熒光讀數，從而導致兩孔之間的熒光值偏差增大。因此，許多研究者開始使用參考染料（如ROX）對這種信號變化進行標準化校正。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR的光學系統

由圖1可知，在傳統實時PCR系統的全板成像中，與角落的孔相比，ZX區域的孔可以檢測到更高的熒光信號。由于ROX信號不受qPCR反應的影響，只要qPCR混合液的屬性保持不變，那么它在整個qPCR過程中也會保持穩定。基于這個原因以及ROX更優越的光譜特性，ROX被視為一個很好的參考染料，可用于熒光信號的歸一化處理，以校準光程差引起的熒光變化。但是ROX作為參考染料的挑戰在于，它占用了一個可能用于檢測靶標的熒光通道。隨著流感病毒和COVID-19新冠病毒（參照ANDiS SARS-CoV-2 and Influenza A/B RT-qPCR Detection Kit）等應用變得越來越普遍，多重反應也越來越常規，這也說明了多通道檢測的重要性。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統采用新型的高性能光學系統，在qPCR實驗中無需ROX校準。該光學系統采用16組光纖單孔掃描設計，一根光纖用于高能LED激發，另一根用于光信號檢測，可16孔同時采集，確保數據采集的一致性（圖2）。此外采用“全孔檢測”技術，每個孔可采集大約100,000個數據點，檢測時取讀數的平均值，JZ測定每個孔的熒光強度（圖3）。這種“全孔檢測”為每個采集時間點提供了比單孔掃描系統更具重現性和可靠性的數據，因為單孔掃描系統僅僅采集少量的數據點。

應用實例：

1、方法：

配制20μl反應體系，在Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統進行10個重復孔的qPCR擴增。

2、結果與討論：

結果表明，Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統能很好地檢測到每個qPCR擴增產物。由圖4可知，10個重復孔的擴增曲線高度一致，說明所有孔檢測到的信號均勻增加；計算得出Cq平均值為17.54，標準偏差低至0.02。Cq值的變異系數（CV）為0.13%，也反映了數據的高JZ度。

光纖檢測系統與Marlow-Peltier溫度模塊相結合，在qPCR實驗中實現了孔間信號檢測的均勻性和加熱溫度的均勻性，并且由于每個樣品都是單孔激發和掃描，因此避免了背景信號的干擾。通過10個重復反應的低標準偏差和CV值進一步證明了Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統的產品特點，即可完全消除光程差，不需要使用ROX進行均一化處理，Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統仍能獲得高JZ度的可靠數據。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統

Azure Cielo? 實時熒光定量PCR系統來自于美國Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測通道，根據實驗需求靈活配置。這款產品采用了高能LED作為光源系統，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統，升降溫速率快，可設置12列跨度30°C的溫度梯度；ZY的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準。Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統可為您的科學研究提供高JZ度、高靈敏度和高可靠性的實驗結果。

申請SY

關注“深藍云生物科技”公眾號→云活動→免費SY。

美國Azure Biosystems公司成立于2013年，致力于為分子生物學和細胞生物學提供先進的整體解決方案，是近紅外成像系統，產品從高端掃描成像到常規凝膠成像。2020年推出Azure Cielo實時熒光定量PCR系統。Azure Cielo秉承了公司品牌設計理念，為生命科學研究者提供性能穩定，數據準確可靠，流程智能簡便，結構精巧安全的實時熒光定量PCR系統。

Azure Cielo實時熒光定量PCR系統產品特性

中英文界面操作和分析軟件

性能穩定可靠，實現長時間的連續工作

穩定可靠的加熱模塊和光學系統，確保儀器連續運行＞1000小時，數據依然穩定可靠，重復性高度一致。

在Azure Cielo上，連續運行1000輪PCR實驗，96孔重復/輪實驗（GAPDH定量，1.5小時/實驗）并連續計算Cq值得平均值和Cq值的標準偏差。Cq值=22.4±0.01。

免費索取詳細技術資料: http://cycloudbio.mikecrm.com/6iLygi0

介紹：

Azure Cielo? 3和Cielo? 6 實時熒光定量PCR系統具有ZY的靈敏度。該系統配置新型的高性能光學系統，采用16組光纖單孔掃描設計，一根光纖用于高能LED激發，另一根用于光信號檢測，可16孔同時采集(圖1)。特殊的激發/發射方式保證單孔掃描時僅激發一個孔，光纖傳導也有效消除光散射，完全避免孔外區域的激發，減少背景噪聲的來源，以便更靈敏的檢測。

同時Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統采用“全孔檢測”技術，每個孔可采集大約100,000個數據點。檢測時取讀數的平均值，JZ測定每個孔的熒光強度。這種“全孔檢測”為每個采集時間點提供了比單孔掃描系統更準確的數據，因為單孔掃描系統僅僅采集少量的數據點。

如何可靠地檢測低拷貝數的靶標呢？首先要考慮引物和探針的特異性，這會直接影響qPCR檢測能力的高低，其次考慮靈敏度，即當探針信號高于背景噪聲時儀器檢測的靈敏度。在其他的反應成分相同的情況下，更高靈敏度的儀器可以更早的檢測到信號或得到更小的Cq值。為了證明Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統在低拷貝數的靶標檢測中的靈敏度和重復性，進行了單拷貝靶標DNA的擴增實驗。

方法：

配制20μl反應體系，利用單拷貝DNA為模板進行qPCR擴增。

分別在Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統和競爭產品的系統上運行兩次96孔板。使用每個儀器提供的軟件收集和分析數據，以確定每個孔的Cq值。

結果與討論：

單拷貝DNA擴增結果發現，在Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統中檢測到88個孔(92%)有熒光信號，競爭產品中檢測到77個孔(80%)(圖2A)，結果表明，Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統提高了單拷貝擴增的檢測概率，這也反映了其檢測靈敏度更高。那么對于單拷貝DNA擴增來說，那些沒有熒光信號的孔可能是靶標DNA沒有進入到孔中，所以沒有檢測到熒光信號。

同時發現，Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統測量的Cq平均值比競爭產品要早2個循環(Cq 36.39 vs 38.53)(圖2A)。并且Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統的Cq值SD小于競爭產品的值(0.91 vs 1.16)，這進一步說明了Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統的檢測具有良好的重復性。

此外，將兩者的擴增曲線進行比較，發現在競爭產品上某些擴增曲線起峰較晚，擴增曲線起峰位置不一致（圖3B），Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統的擴增曲線起峰位置基本一致（圖3A）。這也說明了Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統高靈敏度的“全孔檢測”技術和多數據點的捕獲方式可以給您帶來真實可靠的擴增結果。

總的來說，隨著靶標DNA數量的減少，qPCR的可靠性也會逐漸降低，然而現代應用不斷突破這一技術的極限，對qPCR的性能提出了更高的要求。以上結果證明了Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統具有ZY的靈敏度和可靠性，即使檢測單拷貝DNA分子，仍可獲得具有高度重復性的定量數據。

參考文獻：

1. Lockey C, Otto E, Long Z. Real-Time Fluorescence Detection of a Single DNA Molecule. BioTechniques. 1998; 24:744–746.

2. Stowers CC, Haselton FR, Boczko EM. An Analysis of Quantitative PCR Reliability Through Replicates Using the Ct Method. J Biomed Sci Eng. 2010;3(5):459-469.

3. Stadler J, Eder J, Pratscher B, et al. SNPase-ARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation-Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients. PLoS One. 2015;10(11):e0142273.

4. Tosiano MA, Jacobs JL, Shutt KA, et al. A Simpler and More Sensitive Single-Copy HIV-1 RNA Assay for Quantification of Persistent HIV-1 Viremia in Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. J Clin Microbiol. 2019;57(3):e01714-e01718.

我們都知道在實時定量PCR（qPCR）中，可以通過Cq值和標準曲線得出樣本的初始拷貝數。但Cq值與樣品中靶標的拷貝數有關，也會受到PCR反應的效率和儀器檢測靈敏度的影響。高靈敏度的儀器可以減少檢測樣品所需的循環數，節省時間并提高效率；同時也可以減少假陰性的存在。Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統的設計初衷，就是為了高靈敏高性能而生，每個孔配有單獨的激發和發射光纖，可有效提高靈敏度并降低背景噪聲干擾（圖1左）。此外跟同類產品相比，Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統使用全孔檢測技術，每個孔可采集約100,000個數據點，使每個qPCR擴增曲線能夠準確、可重復和靈敏地表示熒光強度，從而提高熒光數據的可靠性（圖1右）。

▲ 圖1. 高性能光路系統

為了進一步表明Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統的靈敏度，與同類產品進行了以下比較實驗：使用酵母的三個RNA靶標進行檢測，分別是高豐度的Actin基因、低豐度的6Y’端粒基因，以及單拷貝的TEL06R端粒基因。

材料和方法

從10mL酵母培養液中制備出RNA，將3μg RNA逆轉錄成cDNA作為模板備用。對于Actin，在Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統上使用的cDNA按1：20稀釋；其他的cDNA均按1：10進行稀釋。引物如下：

▲ 表1. Actin、6Y’端粒基因和TEL06R端粒基因的引物對

采用4個4倍系列稀釋的cDNA模板和一個無模板對照來計算qPCR擴增效率，反應體系和擴增程序如下：

結果和討論

在高豐度Actin和低豐度6Y’端粒基因的檢測中，Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統和同類產品的擴增效率非常相似（表2）。然而，在單拷貝TEL06R端粒基因的檢測中，發現同類產品得到的Cq值偏大，位于35-38之間，導致計算出的擴增效率大于200%，不能作為參考數據；Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統則計算得出E=96%（表2）。

▲ 表2. 各基因的擴增效率及R2值

同時結果表明，盡管Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統的Actin cDNA上樣量僅為同類產品的一半，但Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統的Cq值小于同類產品的Cq值，兩者相差0.65（表3）。針對低豐度的6Y’端粒基因和單拷貝的TEL06R端粒基因，兩者的Cq值差異較大，差值分別是2.25和4.02（表3）。這些結果表明，隨著基因起始拷貝數的減少，Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統靈敏度的提高變得尤為重要。

▲ 表3. 各基因的數據對比

靈敏度也會直接影響數據的準確度和再現性。隨著PCR循環數的增加，非特異性產物或引物二聚體擴增的可能性也增加。尤其是使用非特異性熒光染料（如SYBR green）檢測PCR產物時，更需要避免過多的循環數。因此，在早期循環中檢測擴增的能力大大提高了數據的可靠性。

具有單孔檢測的Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統設計用于最小化背景噪聲和最大化靈敏度，以實現qPCR反應中特異性和精確度。快快申請試用，讓它幫助你優化qPCR實驗吧。

美國Azure Biosystems公司成立于2013年，致力于為分子生物學和細胞生物學提供先進的整體解決方案，是近紅外成像系統leader，產品從高端掃描成像到常規凝膠成像。2020年推出Azure Cielo實時熒光定量PCR系統。Azure Cielo秉承了公司品牌設計理念，為生命科學研究者提供性能zhuoyue穩定，數據jingzhun可靠，流程智能簡便，結構精巧安全的實時熒光定量PCR系統。

Azure Cielo實時熒光定量PCR系統產品特性

中英文界面操作和分析軟件

性能穩定可靠，實現長時間的連續工作

穩定可靠的加熱模塊和光學系統，確保儀器連續運行＞1000小時，數據依然穩定可靠，重復性高度一致。

在Azure Cielo上，連續運行1000輪PCR實驗，96孔重復/輪實驗（GAPDH定量，1.5小時/實驗）并連續計算Cq值得平均值和Cq值的標準偏差。Cq值=22.4±0.01。

免費索取詳細技術資料: http://cycloudbio.mikecrm.com/6iLygi0

熒光定量PCR試劑本生(天津)健康科技有限公司供應：移液器吸嘴，離心管，凍存管，培養皿全系熒光定量PCR耗材，產品包括：PCR單管、PCR八聯管、96孔板、384孔板。

熒光定量PCR試劑

產品優勢：本生生物代理實驗室R耗材品種全，可替代儀器原廠耗材，性價比高，質量穩定，對用戶可以節省實驗成本。

適應客戶：醫院檢驗科PCR實驗室，驗室；第三方檢測機構，科研院所，大專院校，制藥廠，試劑生產廠家，疾控，檢驗檢疫。

出色的性能
精確、穩定、響應時間、可重復性、可靠性……

一個傳感器可適應大范圍的液體流量范圍
適應液體流量范圍從1.6 μL/min到3.3 mL/min

廣泛的液體兼容性
水、油、酒精、混合物……，與多種液體配合使用，無需校準。

專門為微流體實驗定制的流量傳感器
我們與Bronkhorst合作開發了一種適用于微流體實驗的獨特的科里奧利流量傳感器。它提供了各種優點：精確、范圍廣，直接兼容所有液體（無需校準）……

微流體OB1壓力控制器 + BFS流量傳感器：專用于微流體的流量控制
憑借我們的特定PID控制，與我們的壓力控制器OB1配合使用的Bronkhorst流量傳感器BFS可以通過壓力控制的性能輕松控制液體流量。

特點和優勢

BFS流量傳感器專為滿足微流體要求而設計，基于科里奧利測量原理。在1.6μL/min到3.3mL/min的寬流量范圍內的性能允許您只需要使用單個傳感器便可實現。它是使用其他幾種傳感器的智能且經濟的替代方案。

我們所有的壓力控制器系統（OB1、AF1）都可以與BFS流量傳感器配合使用。使用我們的反饋回路PID，您可以監控和控制微流體實驗裝置中的液體流速，同時保持壓力驅動流的穩定性和響應性。

優勢
（1）大流量范圍：使用同一個傳感器，從1.6μL/min到3.3mL/min
（2）優異的重復性和長期穩定性
（3）易于安裝（氣泡夾雜物風險低）
（4）無需定期重新校準
（5）換液后無需重新校準
（6）zhuo越的性能：精確、穩定、響應時間、重復性……

裝置圖
 
享受平滑且無脈沖的流動
科里奧利流量傳感器BFS與Elveflow儀器的極壓穩定性相結合，確保在首次使用時增強流量控制。您可以將液體流量傳感器插入微流體裝置中的任何位置，記錄計算機上的流速并使用我們的壓力控制器調整流量。

高級科里奧利流量傳感器
Mini-cori-flow微流體科里奧利流量傳感器包含一個獨特形狀的單回路傳感器管，構成振蕩系統的一部分，提供了zhuo越的流量測量性能。當流體流過管時，科里奧利力引起可變相移，其由傳感器檢測并饋送到整體安裝的印刷電路板中。得到的輸出信號嚴格與實際質量流量成比例。科里奧利質量流量測量快速、準確、易于安裝且有固有的雙向性。流體的密度和溫度可作為次級輸出。

主要應用領域
（1）過程工業：（石油）化工、玻璃生產、催化作用過程、化合物半導體處理
（2）能源：燃料電池、太陽能電池、核能、天然氣和FDP技術
（3）生命科學：生物技術、YL、食品和制藥行業

（4）分析測試：氣體和液體的色譜、質譜、污染測試

（5）冶金：鋼鐵、鋁

（6）半導體產業：化學氣象沉積、蝕刻、清洗（超臨界CO2）

（7）食品、飲料和醫藥：釀酒、乳品、包裝

（8）醫用微量化學或分析裝置
（9）校準實驗室

（10）微流控實驗室

特色
（1）高精確度
（2）直接的質量流量測量，與流體特性無關
（3）額外的密度和溫度輸出
（4）雙向測量
（5）反應快

規格參數

USB流量傳感器軟件模塊（ESI圖形界面控制軟件）

得益于直觀的圖形用戶界面，Elveflow智能界面ESI軟件可以控制和使用Elveflow的所有儀器，從Z簡單的初學者命令到Z復雜的專家操作。更多關于ESI軟件的詳細介紹，請參見 Elveflow微流控智能界面控制軟件ESI介紹 。

通過C、Python、MATLAB、LabVIEW或Elveflow智能界面來控制您的實驗。Elveflow智能界面是一個軟件應用程序，提供微流體科學家所需的所有功能。

科里奧利原理
Mini Cori-Flow根據科里奧利原理工作。Mini Cori-flow傳感器可用于同時測量質量流量、溫度和密度。當流體流過振動管時，產生科里奧利力并使管彎曲或扭曲。通過Z佳定位的傳感器檢測極小的管位移，并進行計算。由于傳感器信號的測量相移與質量流量成正比，因此，mini Cori-flow傳感器可以直接測量質量流量。一個重要的關鍵是該測量原理與密度、溫度、粘度、壓力、熱容量或電導率無關。管子始終以其固有頻率振動，這不僅是管子幾何形狀和管子材料特性的函數，而且還是依賴于振動管子中的流體質量。

相關應用

微流體BFS科式流量傳感器（直接測量，無需校準；兼容所有液體如水、油、酒精、混合物等），請點擊 這里

MFS-微流體熱式流量傳感器的詳細介紹，請點擊 這里

多通道微流體壓力&真空控制器OB1 MK3+的詳細介紹，請點擊 這里

Elveflow微流控儀器專用的智能圖形化界面操作軟件ESI詳細介紹，請點擊 這里

如何使用微流體壓力泵OB1壓力控制器和流量傳感器BFS控制微流體流量？請點擊 這里

如何使用微流體壓力泵OB1和BFS科式流量傳感器高精度的控制微流體系統中的流體流速? 請點擊 這里

熒光定量PCR特點：現代分子生物學研究中的重要工具

熒光定量PCR（qPCR，Quantitative Polymerase Chain Reaction）技術是一種用于定量分析特定DNA或RNA序列的實驗技術。近年來，隨著生物醫學研究的迅猛發展，熒光定量PCR已成為分子生物學中不可或缺的工具。其獨特的優勢，如高靈敏度、精確度和實時監控等，使其廣泛應用于基因表達分析、疾病診斷、基因拷貝數檢測以及病原微生物檢測等多個領域。本文將深入探討熒光定量PCR的主要特點，并分析其在現代分子生物學研究中的重要性和應用前景。

一、實時監控與高靈敏度

熒光定量PCR的大特點之一是能夠實時監控PCR反應過程中的DNA擴增情況。在傳統PCR中，擴增結果通常通過凝膠電泳檢測，而熒光定量PCR則通過熒光染料或熒光探針實時檢測PCR產物的增加量，從而可以在擴增的每一個循環中獲取數據。這一過程不僅能提供定量數據，還能精確地反映每個樣本中目標基因的初始濃度。

熒光定量PCR具有極高的靈敏度，能夠檢測到極低濃度的DNA或RNA樣本。即使是微量的基因或病原微生物，也可以通過這種方法實現準確的定量分析，這對于早期診斷和低拷貝數基因檢測至關重要。

二、廣泛的應用領域

熒光定量PCR的應用范圍極為廣泛，涵蓋了從基礎研究到臨床應用的多個領域。在基因表達研究中，qPCR被廣泛用于分析特定基因在不同條件下的表達水平變化。通過比較不同樣本中目標基因的表達量，研究人員可以揭示基因調控的機制和與疾病發生的關系。

在臨床診斷中，熒光定量PCR也發揮了重要作用。例如，病毒載量的檢測、癌癥相關基因突變的檢測等，均可通過qPCR進行定量分析。熒光定量PCR還可用于檢測病原體，如細菌、病毒等微生物的感染水平，從而為疾病的早期診斷和提供可靠的依據。

三、快速高效且具有高精確性

熒光定量PCR的另一個顯著特點是其高效性。與傳統的PCR方法相比，qPCR不僅能夠在較短時間內完成實驗，還能通過使用專門的熒光探針或染料，提高對特定DNA或RNA序列的檢測精度。不同于傳統PCR僅能提供陽性或陰性的結果，熒光定量PCR能量化每個樣本的擴增過程，提供更加詳細的數據，確保實驗結果具有更高的可靠性。

這種高效性和精確性使得熒光定量PCR成為了臨床實驗室、研究機構以及生物技術公司日常工作中的工具。通過精確控制每一個PCR周期，熒光定量PCR能夠有效減少實驗中的誤差，提高實驗結果的可重復性。

四、定量化與高通量檢測

隨著大規模篩選和高通量數據分析的需求不斷增加，熒光定量PCR技術也在高通量檢測中發揮著越來越重要的作用。通過多重PCR反應，研究人員可以同時檢測多個目標基因，這大大提高了實驗的通量和效率。熒光定量PCR的定量化能力使其在基因組學、轉錄組學等高通量分析中，成為了數據采集的核心技術。

五、結論

熒光定量PCR憑借其高靈敏度、實時監控、高精度及廣泛的應用領域，已成為分子生物學研究和臨床診斷中的重要工具。其在基因表達分析、病原檢測、基因突變篩查等方面的優勢，使其在科研和臨床工作中扮演著至關重要的角色。隨著技術的不斷發展，熒光定量PCR的應用前景將更加廣闊，為生命科學領域帶來更為深遠的影響。