考慮到mRNA轉錄的高度動態特性以及樣品處理和下游處理步驟中引入的潛在變量，RT-qPCR工作流程的每個步驟的標準化方法對于可靠和可重現的結果至關重要。MIQE為這種方法提供了一份包含85個參數的清單，以確保質量結果符合任何期刊的接受標準。接下來，小編將為大家詳細介紹如何應用MIQE指南來建立一個可靠的RT-qPCR實驗流程。

1、實驗設計

正確的實驗設計是任何基因表達研究的關鍵。由于mRNA轉錄對與研究過程無關的外部刺激敏感，因此嚴格控制和設計實驗條件的工作是十分重要的。其中包括了確定實驗程序、對照組、重復組的類型和數量、實驗條件以及各組內的樣品處理方法等，這些對于最小化變異性至關重要（表1）。

2、RNA提取及質控

樣品需-80℃冷凍或使用RNA儲存溶液進行儲存。RNA提取程序應包括DNA酶處理步驟，以去除任何的基因組DNA污染。

確保僅使用高純度（無污染物）和高完整性（未降解）的RNA是RT-qPCR實驗工作流程中最關鍵的一點。RNA樣本中的雜質可能導致RT和PCR的YZ，從而導致不同和不正確的定量結果。由于樣品純度和完整性不相關，因此應評估兩者確定RNA樣本符合下游工作流程的ZD驗收標準。

3、逆轉錄

考慮到RNA酶在環境中的普遍存在，建議在質量控制評估后立即將總RNA樣本反轉錄成cDNA。這將避免RNA樣品在轉化為cDNA之前多次冷凍/解凍而降解的風險。對于RT步驟，關鍵是確保提取的RNA樣本中轉錄基因組的一致性和完整性。建議使用相同數量的總RNA，并保持所有實驗樣本的反轉錄反應時間，以最小化生物復制之間的變異性。

4、引物和擴增子設計

引物設計和靶序列的選擇是保證擴增產物特異性和GX性的關鍵。目前有許多軟件或在線網站可設計引物對和確定擴增子，比如DNAMAN、Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、Primer-Blast、BathPrimer、Primer3 Plus等等。

5、qPCR驗證

qPCR驗證是使用一組標準樣品對引物退火溫度、反應效率和特異性的適度范圍進行評估的方法。具體步驟如下：

1)根據儀器類型，選擇合適的耗材和qPCR試劑；

2)配置不同的PCR反應體系，凝膠電泳檢測引物適宜濃度以及特異性；

3)設置溫度梯度測試引物適宜退火溫度；

4)實驗設置NTC、NRC、POS和NEG等對照組，來監控實驗體系或污染；

5)標準曲線的建立(評價PCR效率)。

6、內參基因的選擇

在RT-qPCR實驗中，內參基因可以用于校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。一個好的內參基因應在不同時空樣本或不同處理樣本中具有相對穩定的表達水平，常見的有ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。

7、實驗重復性

基因表達實驗中有兩種可能影響結果的變異來源：

1)由于個體有機體、組織或細胞樣品之間基因表達水平的固有差異引起的生物變異性；

2)實驗過程本身的技術變異性，通常與移液器誤差、操作誤差或樣品質量和數量有關。為了減輕生物和技術變異性的影響，一般認為至少三次生物學重復和技術重復。

看完整個RT-qPCR實驗流程，您是不是撥開RT-qPCR神秘的面紗了呢，現在快快來申請Azure Cielo? 實時熒光定量PCR系統，來感受Azure Cielo?帶給您的真實可靠的RT-qPCR數據。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統

Azure Cielo? 實時熒光定量PCR系統來自美國Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測通道，根據實驗需求靈活配置。這款產品采用了高能LED作為光源系統，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統，升降溫速率快，可設置12列跨度30°C的溫度梯度；CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準。Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統可為您的科學研究提供高靈敏度和高可靠性的實驗結果。

//什么是氣管插管？為什么要進行氣管插管？

氣管插管（以下簡稱插管）是指將一特制的氣管內導管經聲門置入氣管，進而打開病患呼吸道，為氣道通暢、通氣供氧、呼吸道吸引和防止誤吸等提供ZJ條件。插管是實施危重病患搶救過程中的一項重要技術，也是實施吸入麻醉的基礎操作。

氣管插管的主要作用：

◆ 保持氣道通暢：防止口腔分泌物和胃內容物被誤吸。

◆ 通氣供氧：良好的氧氣供應和輔助通氣有助于機體的組織氧供，可以有效預防并發癥出現，并在術中出現緊急情況時及時進行急救。

◆ 控制麻醉深度：相比于注射麻醉和面罩吸入麻醉，經氣管插管可以有效地控制通氣從而控制麻醉深度；同時插管可以防止麻醉氣體向周圍環境的逸散，保護手術人員不會較多地吸入麻醉藥。減少麻醉氣體的浪費，更經濟。

//最常用的犬貓氣管導管-Murphy型

①接頭-連接麻醉機供氣系統；②導管；③套囊-密閉氣道、避免誤吸、固定導管、保護氣管（保持導管位于氣道ZY，避免JD損傷氣道）；④測試球囊-給套囊充氣，可判斷充氣是否合適；⑤充氣連接管；⑥Murphy孔-可以防止導管JD意外貼于氣管壁時發生通氣堵塞；⑦JD。導管外壁標識，ID為導管內徑（mm）；OD示值為導管外徑（mm）；刻度（cm）10、12、14、16、18…表示導管JD到刻度的距離，提示導管插入深度。

//如何選擇合適的氣管插管？

◆ 根據動物的體重選擇對應規格的氣管導管：

▲Tip：體重非常小的動物，管徑選擇1.5, 2.0, 2.5mmID；特定品種不適用，短頭品種一般氣管較細，需要的型號較小；長吻犬的氣管較粗，需要的型號大。所以臨床應用還要結合體型、品種等因素綜合評估。

◆ 對比動物的鼻中隔：將氣管導管JD抵于動物鼻中隔處，選擇外徑和鼻中隔寬度相當氣管導管，同時另取前后兩個ID（一大一小）的氣管導管備用。

▲Tip：獸醫還是要在具體操作的過程中根據實際情況做調整。

//氣管插管前需要做哪些準備？

◆ 潤滑劑或局麻劑：利多卡因凝膠

◆ 3種型號的氣管插管

◆ 紗布若干

◆ 無針頭注射器&套囊壓力計

◆ 喉鏡，確認光源沒問題

//如何進行氣管插管？

劃ZD：氣管插管操作

◆ 選擇合適的氣管導管（見前文）

◆ 檢查氣管插管套囊有無漏氣：用注射器針管通過測試球囊向套囊注射空氣使套囊充盈，按壓套囊，套囊漏氣則廢棄，不漏氣的可準備實施氣管插管。

◆ 修剪插管為合適長度：比對犬齒到肩胛骨中前緣（第2-3肋骨處）的距離，拔掉接口，修剪插管為合適長度，重新連接接口即可。

◆ 導管壁涂利多卡因凝膠(必要時可將利多卡因氣霧劑噴于喉頭)，以減少喉痙攣

◆ 保持下頜與頸成一條直線，開口，拽出舌頭

◆ 配合喉鏡，將插管經聲門裂插入氣管

◆ 套囊適度充氣，用套囊壓力計量取壓力在20 cmH2O；如無套囊壓力計，則使用注射器充盈到合適壓力，如下圖：

◆ 確認插管正確插入：①導管插入氣管內 ②導管插入深度合適 ③氣道密閉

1. 直視法：看到插管位于氣管內；

2. 呼吸袋、氣道壓力表、呼吸活瓣伴隨動物呼吸或人為按壓胸廓有同步變化

3. 透明管上可以看到呼出的霧氣；

4. 觸診頸部只能摸到一個剛性管狀結構；

5. 正壓通氣時可聽診肺音，可看到胸壁膨脹；

6. 通過呼氣末CO2數值及波形圖進行判斷

◆ 固定插管，連接麻醉機

//拔氣管插管的時機

以上是氣管插管基本的介紹，get 更多常用氣管插管產品信息，歡迎識別下方二維碼咨詢。

求《近紅外光譜解析實用指南》

目前，越來越多的領域都會用到數字PCR（dPCR）技術，但關于實驗細節和結果評估缺少一個共識。在很多發表的文章中都缺乏足夠的dPCR實驗細節，這樣不利于評審文章，甚至難以根據文章重復實驗。

為了讓大家更好地遵循MIQE進行實驗，科學家依托于法國Stilla Technologies的Naica數字PCR平臺發布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR? for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通過6色熒光數字PCR技術檢測了乳腺癌相關靶點，并借此闡述了整個數字PCR操作流程以及如何運用MIQE。

轉發邀請有獎啦

歡迎大家轉發邀請小伙伴一起來學習，直播邀請“榜上有名”即可領取精美小禮品哦，報名時可填寫上詳細的地址，小編會后安排郵寄哦。