背景導讀—何為嵌合狀態的檢測？

gusui和外周血干細胞移植是許多惡性和非惡性疾病的有效ZL方法。造血干細胞移植后，受體產生新的血細胞，這些血細胞在遺傳上來自于供體DNA。確認新的造血系統來源于供體是臨床復發監測的重要組成部分。一般采用血細胞基因型檢測的方式，稱為嵌合體分析。完全供體細胞嵌合狀態意味著100%的血細胞來自供體，而混合或部分嵌合意味著受體細胞也存在。因此檢測時需要分析受體在移植后的血液或gusui中供體和受體的基因型的各自比例。

法國蘇黎世輸血服務ZX實驗室使用Stilla Technologies的Naica? Crystal數字PCR系統進行雙等位基因單核苷酸變異（SNV）檢測，從而確定嵌合體狀態。

嵌合體檢測的兩步策略

移植前：要想得到正確的移植后的檢測結果,必須選擇合適的標記物，蘇黎世輸血服務ZX實驗室建立了一個由24種特定SNV分析組成的組合，用于尋找在單個樣品分析中篩選供體和受體DNA的合適標記。

移植后：在臨床上，嵌合體監測至少需要0.5%的等位基因敏感性。Naica? Crystal 數字PCR僅使用5ng DNA，就達到了所需的0.5%的靈敏度。使用標準的20ng DNA進行檢測可以使一個等位基因頻率的可重復量化精度達到0.25%。(圖2)

總結

Naica? Crystal數字PCR在造血干細胞移植后嵌合狀態檢測方面的優勢：

?  可與建立的SNV嵌合體檢測方法完全兼容。

?  使用Naica?系統進行的標準測試可使等位基因頻率檢測靈敏度降至0.25%，遠低于0.5%的臨床限值要求。

?  此次研究，使用了Naica?系統中的高通量Opal芯片，一次可檢測48個樣本，每個樣本可進行3熒光通道讀取，僅需較低的DNA輸入量，即可實現更高的樣品通量和譜系特異性嵌合體檢測的能力。

法國Stilla Technologies公司開發的—款多重PCR專用預混液：naica^?multiplex PCR MIX（見表1），專用于naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統的多重檢測。并對naica^?multiplex PCR MIX的多重檢測性能進行了詳細評估。當面對有限的樣本量時，可保證多重數字PCR檢測的靈敏度和準確性；在復雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。

★ naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數字PCR上進行6個靶標的同步準確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統上進行6個靶標的線性范圍分析，結果顯示6個靶標的R²均＞0.99，說明在naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統上，能夠可靠地實現6靶標同步準確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數字PCR預混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數字PCR預混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣品加入量的增加可提高檢測靈敏度。

▲ 圖1：使用naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數字PCR上進行6個靶標的線性分析，分別在藍色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個通道進行檢測。每個稀釋點的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個稀釋度進行3次重復。結果顯示6個靶標的R2均大于0.99，說明所有靶標的結果都高度真實可靠。

★ 在復雜的背景基因下，對低豐度目的基因進行精確定量

數字PCR的—個重要技術優勢是能夠在存在多個靶標擴增的情況下檢測到低濃度靶標。為了評估naica^?multiplex PCR MIX的穩定性。使用同一個目標DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進行檢測，同時其中摻入5種外部靶標模板（每個靶標的濃度為3000 cp/ul)。在不同測試條件下，結果均呈現良好的線性關系（圖2A和2C)。這些結果與同一DNA 靶點在不同濃度下單獨檢測以及在不添加外部靶標的情況下獲得的結果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^?multiplex PCR MIX的擴增結果真實可靠。將pUC18質粒（圖A和B)和pUC57質粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個外部擴增靶標背景下（每個靶標為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(B,D)的情況下進行定量檢測，3次重復。線性擬合系數 R2>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對所有靶標的測定結果都是真實可靠的。5個外部靶標的相對標準偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復性。

★ naica^?multiplex PCR MIX應用亮點

?  實現數字PCR方法多重檢測的高度穩定性和高檢測靈敏度；

?  可在naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統的動態范圍內同時定量檢測6個獨立的DNA靶標，均具有良好線性關系；

?  5X和10X的數字PCR預混液，提高了naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統高階多重檢測能力；

?  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣本加入量的增加可提高檢測靈敏度。

表1 naica^?multiplex PCR MIX貨號及規格

naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統，源于Crystal微滴芯片式數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的拷貝數濃度。

導讀

反芻動物是指具有反芻習性的一類哺乳動物，如牛、羊、長頸鹿、兔子等。反芻動物采食一般比較匆忙，大部分未經充分咀嚼就吞咽進入瘤胃，經過瘤胃浸泡和軟化一段時間后，食物經逆嘔重新回到口腔，經過再咀嚼混入唾液并再吞咽進入瘤胃，這種行為稱為反芻行為。反芻動物的食物種類比其他種類的動物更豐富，結構組成也更復雜，但草料中的粗纖維含量較高導致其難以消化，反芻動物依賴于胃部微生物群的代謝能力來消化各種物質，但其轉化效率低也是養殖業廣泛關注的問題。

雖然已有研究證明瘤胃中不同微生物的活性可以調節宿主利用植物生物能量的能力，但定植于宿主瘤胃中的微生物卻很少受到關注。奧地利維也納獸醫大學的Cameron等人在Research Square在線發表了題為《Differential partitioning of key carbon substrates at the rumen wall by recently diverged Campylobacteraceae populations》的研究論文。文章采用多重數字PCR（dPCR）量化同一菌科的兩種菌群，分析反芻動物瘤胃上的定植菌群分布及生物進化動態，為今后畜牧業提高動物代謝能力的研究提供了新思路。

應用亮點：

?  宏基因組測序發現瘤胃上皮細胞中彎曲桿菌科兩個種群的基因序列高度相似，利用naica?微滴芯片數字PCR系統可以對兩個種群進行精準量化。

? 使用不同培養添加物后，可以利用naica?微滴芯片數字PCR系統進行微生物種群分布跟蹤。

研究成果：

作者通過對瘤胃上皮微生物組的16S rRNA擴增子分析發現了一個優勢菌株（OTU）為彎曲桿菌科（Campylobacteraceae），并通過宏基因組測序發現該OTU兩個主要種群Ca. C. stinkeris與Ca. C. noahi的基因含量高度相似，但pgl（蛋白質糖基化）操縱子不同。

為了探究Ca. C. stinkeris與Ca. C. noahi兩個種群空間分布的差異，作者通過naica^?微滴芯片數字PCR系統比較了這兩個種群在不同動物瘤胃乳突離上皮壁最近和最遠兩個位置的含量。結果發現不同動物的兩個種群在這兩個位置的比例接近。

▲圖1 Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在動物瘤胃乳突頂端和隱窩的含量比例。A）從乳突切片兩個位置提取DNA使用dPCR進行定量分析。B) Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在動物瘤胃乳突兩個位置的含量比例。橫坐標為取樣動物的名字。

然后作者使用naica^?微滴芯片數字PCR系統對兩種菌群進行生長和適應性測定，數據顯示Ca. C. stinkeris可以在以醋酸鹽為主要碳源時積累的生物量，更好地生長，但被丙酸鹽抑制，而Ca. C. noahiz在任何一種添加物存在的情況下在都沒有檢測到生長優勢。因此，作者推斷可能存在一些其他機制來最小化競爭，這種機制通過某些代謝生態位維度上的分化，防止它們生長動力學的重疊來支持兩個種群的共存。

▲圖2 醋酸鹽利用和丙酸鹽抗性檢測。A)通過種群特異性dPCR，評估添加5 mM醋酸鹽（acetate）或丙酸鹽（propionate）對生物量積累的影響。分別用單個菌株(左，單一培養)和競爭菌株(右，共培養)進行了實驗。

通過數字PCR這種定量技術，作者發現在瘤胃乳突的頂端和隱窩都分布有這兩種優勢菌群，且與上皮細胞分布數目無顯著的相關性。另外，這兩種菌群能夠促進相關脂肪酸的代謝，進而發揮促進食物消化的功能。該文章為通過調節反芻動物體內某些鹽離子濃度來調節優勢菌群的分布比例進而提升消化能力提供了思路。

全封閉Naica數字PCR新型冠狀病毒超敏檢測方案

Cycloud與MicroFuture合作

深藍云生物科技與北京微未來科技，基于國家疾控ZX和WHO推薦區域，針對2019新型冠狀病毒的四段保守序列作為檢測靶標，開發超敏的數字PCR檢測方法和快速的定量PCR檢測方法。

【圖源：北京微未來科技】

區段分別為：RdRP基因（特異性靶點），E蛋白基因，N蛋白基因，保守基因S區位點。確保對2019新型冠狀病毒鑒定的高度特異性和靈敏度。      

與人冠狀病毒HcoV-229E、 HcoV-HKU1、 HcoV-OC43、 HcoV-NL63等型無交叉。

深藍云生物科技以專業服務科學為使命，愿所學，以致用，共戰病毒！

北京微未來科技有限公司以“解碼病原微生物，致力于傳染病防控”為企業使命。與北京深藍云生物科技共同在病毒的超敏檢測的數字PCR方法展開深入合作。 

聯系方式：

公司名稱：北京深藍云生物科技有限公司
聯系電話：010-57256059
E-mail：info@cycloudbio.com

在2021版的Methods in Molecular Biology·Lung Cancer第10章(127頁開始)介紹了使用naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統檢測NSCLC患者ctDNA樣本中的19種活化和耐藥位點，并對檢測方法進行了詳細的描述。

naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統檢測流程

文中闡述，naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統多重檢測速度快，每個患者樣本可獲得大量突變信息，通過naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統進行液體活檢可實現高靈敏度和高效的治療監測，早期發現治療耐藥性。

Methods in Molecular Biology是Springer出版的權威分子生物學方法學系列著作，共1110冊，涵蓋了生物學的方方面面。包括生命科學、藥物科學、化學、藥學、材料學、細胞生物學、生物化學、人類基因組學、植物性、免疫學等。Lung Cancer就肺腫瘤生物學常用的實驗方法進行了深入的討論和細致的描述，包括用于建立肺癌診斷和預后的相關研究方法。

naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統，源于Crystal微滴芯片式數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的拷貝數濃度。

導讀

在過去的幾十年中，糖尿病的發病率在顯著增長。除了不健康的生活方式外，環境污染物被認為是糖尿病發生的危險因素。多環芳烴 (PAH)是一類含有2-7個芳環的有機化合物，由自然和人類活動產生并廣泛存在的污染物。流行病學研究表明，PAHs水平與成人和兒童的肥胖和二型糖尿病相關。

廈門大學生命科學學院細胞應激生物學國家重點實驗室的研究人員在Ecotoxicology and Environmental Safety上發表了題為《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中應用naica?微滴芯片數字PCR系統對胰島素編碼基因DNA甲基化水平進行量化，揭示了產前暴露于多環芳烴混合物對成年雄性小鼠胰島細胞功能的不良影響。

應用亮點：

?  使用naica?微滴芯片數字PCR系統對胰島素編碼基因啟動子甲基化水平進行量化。

? 在產前暴露于500μg/kg PAHs的小鼠中，胰島素編碼基因啟動子的甲基化水平顯著升高。

? 產前暴露于PAHs可能促進I型糖尿病的發病。

作者使用8種PAHs的混合物進行了實驗，以研究產前PAHs對成年期胰島細胞功能和質量的影響，同時試圖闡明 I型糖尿病發病的環境原因。他們分離了成年雄性小鼠的胰島，對胰島素編碼基因的啟動子DNA甲基化水平進行分析。

研究成果：

▲圖1. 產前暴露于多環芳烴對成年雄性小鼠胰島素編碼基因甲基化水平的影響。(A) 數字PCR結果代表性一維圖。(B)胰島素編碼基因啟動子甲基化水平。(每個處理三只母鼠, 每只母鼠取一個雄性后代) 。

在本研究中，子宮內暴露于500μg/kg PAHs的小鼠胰島中胰島素編碼基因啟動子中的DNA甲基化水平顯著增加，同時胰島素編碼基因轉錄顯著下調。

▲圖2. 不同PAHs濃度對胰島素編碼基因轉錄水平的影響

期刊介紹：

Ecotoxicology and Environmental Safety 1977創刊，隸屬于愛思唯爾出版集團。是一份多學科交叉期刊，主要研究環境污染對包括人類健康在內的生物體的暴露和影響。最新影響因子為7.129。

naica?六通道數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司naica?六通道數字PCR系統，源于Crystal微滴芯片式數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數濃度。