從1985年至今的30多年時間里，PCR分析經歷了三代技術的發展。DY代傳統PCR技術，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR產物進行定性分析。第二代熒光定量PCR技術，通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監控PCR進程，ZH用Cq值對基因進行定量分析。第三代數字PCR技術，通過將PCR反應液進行有限稀釋，實現核酸分子的單分子擴增，ZZ采取終點法檢測陽性微滴的熒光信號，有熒光信號的微滴判讀為 1；沒有熒光信號的微滴判讀為 0，因此該技術被稱為數字PCR。

PCR技術在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經滲透到分子生物學領域的各種研究層面。尤其在今年大流行疾病中，展現了PCR技術的強大之處。那在科學研究中，我們該如何選擇傳統PCR 、熒光定量 PCR與數字 PCR呢？

首先我們要清楚，三代PCR技術所有的基礎源于PCR反應的基本原理和PCR反應的3個重要階段，分別是指數期、線性期和平臺期。

指數期

指數期內，每個循環PCR產物量大約增加1倍（假定 100%反應效率），該階段的擴增反應具有高度特異性和精確度。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應體系成分的消耗，其中的一個或者多種成分限制反應，導致反應開始減緩，并且每個循環的PCR 產物不再加倍。

平臺期

反應停止，不再產生更多的產物。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每個反應將在不同的時間點進入平臺期，平臺期內可以看到這些差異。

傳統 PCR

傳統PCR通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR終產物進行分析（圖2），它的局限性就在于只能做定性分析。在圖3中，3個反應孔含有相同量的 DNA模板，但到達平臺期后產生的熒光信號卻不同，說明擴增產物的量存在不同（反應動力學變化所致）。這也表明了傳統PCR平臺期測量時結果存在變異，產出的DNA量不一定能反映最初情況，所以無法進行定量。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中，發現在指數期內，3個反應孔的擴增曲線完全重合，說明指數期內進行檢測將更加精確，可實現更加準確的定量。閾值線是擴增產物熒光強度超過背景時的一個熒光強度值，樣品達到此熒光強度值所經過的循環數稱為Cq值。通過比較未知濃度的樣品與一系列標準品的Cq值，可以精確測定未知反應中的模板 DNA數量。

數字 PCR

數字 PCR 是通過將樣本DNA隨機分布至獨立的反應單元中，每個反應單元中包含或者不包含1個或多個拷貝的目標分子，所有獨立的反應單元進行平行擴增后，對每個反應單元的陰性或者陽性熒光信號進行檢測并進行統計學分析，就可以計算出原始樣本的拷貝數，無需參考標準品或內源性對照品，也不需要標準曲線。

傳統PCR 、熒光定量 PCR與數字 PCR的選擇

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Azure  Cielo?實時熒光定量PCR系統

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Naica?微滴芯片式數字PCR系統

法國Stilla Technologies Naica數字PCR平臺是實現高靈敏DNA/RNAJD定量的技術工具，只需一步移液操作，即可自動生成單層平鋪的微滴，同一反應液進行多基因的單分子模板擴增，通過三色或六色熒光通道檢測，自動QC質控，識別多色熒光中有效的陰陽性微滴，從而達到目的DNA/RNA的高JZjuedui定量。同時提供原始數據、單微滴追溯等功能，確保數據真實可靠。

參考文獻：

1. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 1992;13(3):444-449.

2. Vogelstein B , Kinzler K W . Digital PCR[J]. Proceedings of the National Academy of ences of the United States of America, 1999, 96(16):9236-9241.

3. Heyries KA, Tropini C, Vaninsberghe M, et al. Megapixel digital PCR. Nat Methods. 2011;8(8):649-651.

4. Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013;59(11):1670-1672.

5. Whale AS, Huggett JF, Cowen S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(11):e82.

法國Stilla Technologies公司開發的—款多重PCR專用預混液：naica^?multiplex PCR MIX（見表1），專用于naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統的多重檢測。并對naica^?multiplex PCR MIX的多重檢測性能進行了詳細評估。當面對有限的樣本量時，可保證多重數字PCR檢測的靈敏度和準確性；在復雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。

★ naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數字PCR上進行6個靶標的同步準確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統上進行6個靶標的線性范圍分析，結果顯示6個靶標的R²均＞0.99，說明在naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統上，能夠可靠地實現6靶標同步準確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數字PCR預混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數字PCR預混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣品加入量的增加可提高檢測靈敏度。

▲ 圖1：使用naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數字PCR上進行6個靶標的線性分析，分別在藍色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個通道進行檢測。每個稀釋點的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個稀釋度進行3次重復。結果顯示6個靶標的R2均大于0.99，說明所有靶標的結果都高度真實可靠。

★ 在復雜的背景基因下，對低豐度目的基因進行精確定量

數字PCR的—個重要技術優勢是能夠在存在多個靶標擴增的情況下檢測到低濃度靶標。為了評估naica^?multiplex PCR MIX的穩定性。使用同一個目標DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進行檢測，同時其中摻入5種外部靶標模板（每個靶標的濃度為3000 cp/ul)。在不同測試條件下，結果均呈現良好的線性關系（圖2A和2C)。這些結果與同一DNA 靶點在不同濃度下單獨檢測以及在不添加外部靶標的情況下獲得的結果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^?multiplex PCR MIX的擴增結果真實可靠。將pUC18質粒（圖A和B)和pUC57質粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個外部擴增靶標背景下（每個靶標為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(B,D)的情況下進行定量檢測，3次重復。線性擬合系數 R2>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對所有靶標的測定結果都是真實可靠的。5個外部靶標的相對標準偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復性。

★ naica^?multiplex PCR MIX應用亮點

?  實現數字PCR方法多重檢測的高度穩定性和高檢測靈敏度；

?  可在naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統的動態范圍內同時定量檢測6個獨立的DNA靶標，均具有良好線性關系；

?  5X和10X的數字PCR預混液，提高了naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統高階多重檢測能力；

?  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣本加入量的增加可提高檢測靈敏度。

表1 naica^?multiplex PCR MIX貨號及規格

naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統，源于Crystal微滴芯片式數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的拷貝數濃度。

1、什么是PCR

PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，其是一種用于放大擴增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物學技術。這種技術模擬體內DNA的天然復制過程，能將微量的DNA進行特異性的擴增，在短時間內獲得足夠的DNA，是分子生物學研究中不可缺少的一員。

2、標準PCR的過程

此項技術是模擬DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，在整個PCR過程中包含了變性——退火（復性）——延伸三個基本反應步驟。

• DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

• 退火（復性）（40℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

• 延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

3、為什么要使用梯度PCR儀呢

梯度PCR儀是指一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件的儀器，因為不同的DNA片段其最適退火溫度不同，采用梯度PCR儀通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的最適退火溫度，優化反應條件，進行有效的擴增。

在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。

使用普通的PCR儀進行擴增時，只能運行一個特定的退火溫度，當目的基因的退火溫度不適時，就可能出現假陽性，影響實驗結果。而對于梯度PCR儀，不但可以作為普通PCR儀使用，也可以通過設置不同的溫度梯度（通常為12個梯度溫度），研究未知DNA退火溫度的擴增，有效降低或避免假陽性，同時在不理想的工作條件下擴增出產物，既節約成本也提高了實驗效率。

適用于分子生物學、微生物學、遺傳學、細胞生物學、食品科學和農學等領域，進行分子克隆、基因表達分析、基因型鑒定、測序、病原微生物分析等實驗研究。

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在2021版的Methods in Molecular Biology·Lung Cancer第10章(127頁開始)介紹了使用naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統檢測NSCLC患者ctDNA樣本中的19種活化和耐藥位點，并對檢測方法進行了詳細的描述。

naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統檢測流程

文中闡述，naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統多重檢測速度快，每個患者樣本可獲得大量突變信息，通過naica^?六通道微滴芯片數字PCR系統進行液體活檢可實現高靈敏度和高效的治療監測，早期發現治療耐藥性。

Methods in Molecular Biology是Springer出版的權威分子生物學方法學系列著作，共1110冊，涵蓋了生物學的方方面面。包括生命科學、藥物科學、化學、藥學、材料學、細胞生物學、生物化學、人類基因組學、植物性、免疫學等。Lung Cancer就肺腫瘤生物學常用的實驗方法進行了深入的討論和細致的描述，包括用于建立肺癌診斷和預后的相關研究方法。

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0.1ml PCR八聯管pp材質，薄壁設計，適用于使用100ul反應體系模塊的熒光定量PCR儀及普通/梯度PCR儀。

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>正面模刻字母標識，方便樣品識別區分。
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適用于ABI7500fast、stepone/plus；BIO-RADCFX96、MJ；Roche480等100ul反映體系的熒光定量PCR儀及普通PCR儀

英國進口PCR耗材,PCR八聯管 0.2ml PCR八聯管

產品介紹：
適用于常規PCR溫度循環系統和定量PCR系統，包括8聯PCR管和96/384孔PCR板。 純度高達99.9%的聚丙烯、超薄設計、壁厚*均勻的工藝使得熱傳導精確、控溫準確、減少實驗循環時間。通過嚴格的質控和認證確保產品無DNase 、無RNase 、無蛋白酶，內毒素含量控制在安全標準內。獨有的長法蘭管蓋設計，減少樣品蒸發；PCR板裙邊上已標記編號，可以方便加樣。

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　　農藥殘留快速檢測儀(干式法)

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　　細菌培養皿，100x15mm,滅菌，加厚

　　24孔帶蓋細胞培養板，貼壁，平底，透明，單個滅菌包裝

　　12孔帶蓋細胞培養板，貼壁，平底，透明，單個滅菌包裝

　　6孔帶蓋細胞培養板，貼壁，平底， 透明，單個滅菌包裝

　　T-175, 650ml細胞培養瓶，斜口，密封蓋

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　　24-400 EPA/VOA螺紋口樣品瓶及配套瓶蓋和隔墊

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　　圓底螺紋樣品管

　　Qubit試劑耗材

　　50ml離心管錐底,綠色蓋,綠色印刷標記區

　　封板膜 100張/10盒/箱

　　進口Western 孵育盒 Half mini-gel size,75 x 52 x 35mm

　　Tip 0.5-10ul, 短吸嘴 ,無色, 盒裝

　　5.0ml凍存管

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　　100*20mm細胞培養皿，貼壁培養，標準

　　100*20mm細胞培養皿，貼壁培養，標準，滅菌

　　60*15mm細胞培養皿，懸浮培養，滅菌

　　10ml離心管，PP(聚柄烯)圓底

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產品優勢：
1、可替代羅氏、伯樂、ABI、安捷倫、耶拿、艾本德、TaKaRa、力康、天隆、博日、達安、宏石、福生等各熒光定量PCR儀用的單管、八聯管、96孔板、384孔板。
2、PCR耗材品種全，可替代儀器原廠耗材，性價比高，質量穩定，對用戶可以節省實驗成本，對公司每月都有訂單，現貨庫存，順豐快遞配送，下單3個工作日即可到達用戶手中。
適應客戶：醫院檢驗科PCR實驗室，實驗室；第三方檢測機構，科研院所，大專院校，制藥廠，試劑生產廠家，疾控中心，檢驗檢疫。