1、為什么實時熒光PCR法要用質控

由于在樣本處理、核酸提取、PCR擴增整個過程中存在試劑/設備不穩定、核酸提取效率低、樣本交叉污染等問題，所以需要設置質控體系監控核酸提取和PCR擴增全過程。質控體系可以降低實驗誤差，保證樣本檢測的準確性，同時避免檢測過程中的假陰性和假陽性。

2、質控體系質控品的組成

陽性對照（PC）：監控系統故障，一般為含目的成分或片段的質粒。

陰性對照（NC）：監控反應體系污染情況，一般為不含目的成分或片段的質粒。

無模板對照（NTC）：監控反應體系污染情況，一般為去離子水。

內標（內參）：校準生物學誤差，判斷核酸提取有效性及擴增效率。

重復實驗：降低其余誤差，一般為2-3次以上。

GB∕T38164-2019 動物源性成分檢測方法質控品設置示例

動物源性檢測操作中對內參基因18SrRNA進行檢測的方法可在第二通道中進行設置。單通道產品則可在B槽中進行，設置同A槽。 

3、質控體系設置要求及過程控制

一般無特殊要求的實驗需要設置陰陽性對照，如非洲豬瘟病毒檢測（TCVMA 5-2018），食源性致病菌檢測等（SNT1870-2016），要求嚴格的實驗還需設置內參并進行2-3個平行實驗，如動物源性檢測（GB∕T38164-2019），轉基因定量實驗等（GBT19495.5-2018）。

對于涉及人體樣本的臨床診斷而言，除質控品設置外，還需對整個核酸提取和PCR擴增過程進行質量控制。如諾如病毒檢測（GB 4789.42-2016），新冠病毒檢測等。

在實際實驗過程中，需綜合考慮實驗環境、操作流程、實驗成本等實際條件，以便選擇適宜的方法進行質量控制。

（1）擴增控制示例（A5-A7）

GB 4789.42-2016 諾如病毒檢驗 擴增控制示例

規則：YZ指數<2.00，擴增實驗成立，反之，則反應無效。

方法：YZ指數=A6Ct值-A5Ct值，滿足條件，則使用A1孔Ct值作為結果；若不滿足，則判斷A7Ct值-A5Ct值，滿足條件后則使用A2孔Ct值作為結果；若兩個反應孔YZ指數均≥2.00，則反應無效。（反應結果為陽性時也可酌情判定為陽性）

（2） 核酸提取過程控制（A8-B4）

GB 4789.42-2016 諾如病毒檢驗 核酸提取過程控制示例

規則：若核酸提取效率≥1%，則核酸提取有效。若提取效率<1%，則需重新檢測（反應結果為陽性時也可酌情判定為陽性）

方法：通過B1-B4孔建立標準曲線（PC2濃度為1）。核酸提取效率=A8孔Ct值對應的濃度×100%。

4、實時熒光PCR法診斷試驗的評價指標

（1）真實性評價

①：靈敏度：也稱真陽性率，即實際有病且按該診斷試驗被正確地判為有病的概率。

②：特異性：也稱真陰性率，即實際無病按該診斷試驗被正確地判為無病的概率。

③：假陰性率：也稱真陽性率，即實際有病但根據該診斷試驗被定為非病者的概率。

④：假陽性率：即實際無病但根據該診斷試驗被定為有病的概率。

 （2）可靠性評價

①：變異系數：當做定量試驗時，可用變異系數來表示可靠性，即所測平均數的標準差與測定的均數之比。

②：符合率：指同一批研究對象兩次診斷結果均為陽性與均為陰性的人數之和占所有進行診斷試驗人數的比率。

熒光分光光度計測定什么指標？

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成為分子生物學研究不可或缺的一種技術手段，常見應用于基因表達分析、腫瘤疾病診斷、病原微生物檢測、食品安全分析和動植物育種等。qPCR檢測技術由于具有高靈敏度的特性，應盡量避免操作中的實驗誤差，確保獲得可靠真實的數據。那么如何確保實驗數據的可靠性和真實性，則需要通過對qPCR關鍵數據的評估來進行判斷。除此之外，如何分析qPCR異常數據，也是每一位qPCR實驗者需要經歷的必要環節。

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實時熒光定量PCR數據中的基本概念：

在整個擴增過程中會出現基線期，指數期，線性期和平臺期。其中在基線期和指數增長期，擴增產物都是以指數級增長，但是在基線期我們沒辦法檢測；而到了線性期和平臺期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴增效率差別很大，因此沒有辦法計算模板的含量。因此，在指數增長期的CT值就成了計算模板含量的關鍵值。

▲ 圖一：線性圖譜

▲ 圖二：對數圖譜

為什么知道CT值就能夠得到最初的目標基因含量呢？

如圖三，表示一個基因單次擴增曲線。N為擴增產物的分子數，模板的分子數乘以1+擴增效率的n次方，n代表循環次數。也就是說，如果擴增效率為100%，產物的分子數就等于模板數乘以2的n次方。但是在線性增長期和平臺期，擴增效率不可能是100%，因此PCR理論方程只在指數期成立，也就是圖三綠色框的部分。

▲ 圖三

數據處理：

以下三張圖分別表示我們在做熒光定量PCR時提到的三個名稱：擴增曲線、標準曲線、溶解曲線。

1、juedui定量：使用一系列稀釋的已知濃度的標準品與未知樣本同時進行測定，根據系列濃度標準品的CT值與起始模板量之間的線性比例關系。

注意事項：

?  標準品必須來源可靠，濃度已知。

?  標準品要和待測樣品同時在儀器中擴增。

?  只能根據標準品覆蓋的濃度范圍進行待測樣本濃度的推測。

2、相對定量：是用來確定經過不同處理的樣品之間的表達差異或目標在不同時相差的表達差異，也就是倍數差異。

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