如今，隨著快速無創篩查、癌癥檢測以及臨床測序應用的擴大，診斷行業已經鋪平了通往JZYL時代的道路。隨著市場對更kuai、更jingque診斷的需求，以及監管的不斷發展，診斷專業人士需要一個能夠幫助他們建立伙伴關系、獲取行業知識、與同行建立網絡并從同行那里學習的綜合平臺，共同討論診斷行業的發展、里程碑、挑戰和機遇。第12屆Next-Generation Dx峰會將于8月25日-27日（美東時間）進行線上舉辦。

會議期間Stilla Technologies公司也將聚焦“液體活檢”進行交流互動，針對6色Crystal Digital PCR?系統的多重檢測能力進行zuixin技術的分享，大家可以觀看Stilla Technologies應用專家Kimberley Gutierrez博士的演講，并且在會議現場可以訪問我們的線上展位。

Kimerley Gutierrez博士將介紹Stilla的6色Crystal Digital PCR?系統，并闡述其是如何創建1個panel可同時對至少6個癌癥突變位點進行檢測。該報告將于美國東部時間8月25日下午1點25分在“液體活檢”ZT節目中播出。

想了解更多詳情，掃描下方二維碼注冊報名吧！

時間

2020年8月25-27日（美東時間）

會議ZT日程

數字PCR為第三代PCR技術，憑借較高靈敏度和jingzhun度廣泛應用于核酸檢測領域。目前，越來越多的領域都會用到數字PCR（dPCR）技術，但關于實驗細節和結果評估缺少一個共識。在很多發表的文章中都缺乏足夠的dPCR實驗細節，這樣不利于評審文章，甚至難以根據文章重復實驗。

本期在線研討會給大家介紹通過6色熒光數字PCR技術檢測乳腺癌相關靶點，并借此闡述了整個數字PCR操作流程以及如何運用MIQE，希望對大家的文章發表能有所幫助，少走彎路，多發好文章。

掃描二維碼進入直播間

全封閉Naica數字PCR新型冠狀病毒超敏檢測方案

Cycloud與MicroFuture合作

深藍云生物科技與北京微未來科技，基于國家疾控ZX和WHO推薦區域，針對2019新型冠狀病毒的四段保守序列作為檢測靶標，開發超敏的數字PCR檢測方法和快速的定量PCR檢測方法。

【圖源：北京微未來科技】

區段分別為：RdRP基因（特異性靶點），E蛋白基因，N蛋白基因，保守基因S區位點。確保對2019新型冠狀病毒鑒定的高度特異性和靈敏度。      

與人冠狀病毒HcoV-229E、 HcoV-HKU1、 HcoV-OC43、 HcoV-NL63等型無交叉。

深藍云生物科技以專業服務科學為使命，愿所學，以致用，共戰病毒！

北京微未來科技有限公司以“解碼病原微生物，致力于傳染病防控”為企業使命。與北京深藍云生物科技共同在病毒的超敏檢測的數字PCR方法展開深入合作。 

聯系方式：

公司名稱：北京深藍云生物科技有限公司
聯系電話：010-57256059
E-mail：info@cycloudbio.com

11月19日北京時間23:00（巴黎時間：17:00），歐洲分子生物學實驗室研究員Moritz Kueblbeck將于Genomeweb平臺在線分享“在CRISPR編輯的細胞系中使用數字PCR進行標記拷貝數評估”相關知識。

本網絡研討會將介紹如何使用dPCR快速定量CRISPR編輯的HeLa細胞中的綠色熒光蛋白拷貝數。討論還將介紹dPCR的工作原理和采集后的數據分析方法。

Moritz Kueblbeck在德國海德堡的癌癥研究ZX(DKFZ)做了八年的研究員。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的歐洲分子生物學實驗室,在不同實驗室的項目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用內源性的標記蛋白(在HeLa和U-2 OS細胞進行不同標簽的純合敲入)進行人類細胞系基因組編輯。

內容簡介

l  熒光蛋白或自標記是使用熒光顯微鏡研究活細胞中蛋白質動力學的寶貴工具。然而，定量成像需要目標蛋白(POI)的生理表達水平，特別是當需要研究POI的化學計量相互作用時。

l  CRISPR使研究人員能夠標記幾乎任何感興趣的目標基因，使其可以研究相應POI的生理表達水平。然而，正確編輯細胞克隆的產生和選擇——即標記等位基因的預期數量和缺乏額外的整合——需要對標記的拷貝數進行定量評估。

l  探討dPCR是一種快速、可靠的熒光標記CRISPR編輯細胞定量檢測方法。

注冊地址：https://event.on24.com/eventRegistration/EventLobbyServlet?target=reg20.jsp&partnerref=stilla&eventid=2111188&sessionid=1&key=2206BD6DA2548F0F9C46911E3A71DD

AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

為了研究腫瘤微環境影響下腫瘤細胞的運動性和侵襲特性，建立了體外2D侵襲方案。這種2D侵襲方案是一種共培養試驗，在這種情況下，是由腫瘤和基質細胞（例如成纖維細胞）組成的。一旦兩種細胞類型接觸，在不同的條件下評估侵襲成纖維細胞單層的腫瘤細胞的數量，在我們的研究中，我們在模擬實體腫瘤微環境中發現的條件，例如與基質細胞（成纖維細胞）的相互作用以及成纖維細胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我們使用A375黑色素瘤細胞系和真pi成纖維細胞進行了此測定。黑色素瘤細胞激活成纖維細胞，繼而維持腫瘤細胞的生長，惡性轉化和耐藥性（Flach等，2011）。然而，在刺激所測試的抗ai化合物后，我們發現與成纖維細胞直接接觸的黑素瘤細胞顯示出運動能力受損并且未能侵襲成纖維細胞層。

材料和試劑

1. GFP-A375細胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纖維細胞（從健康患者中分離）

3. MEF細胞培養基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 臺盼藍溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最終濃度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm濃度下使用，用DMSO稀釋

儀器設備

1. 層流凈化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 臺式離心機

4. 細胞計數器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/預置2孔插件培養皿（ibidi:81176）

6.細胞培養管

7. 渦旋

8. 鑷子

9. 光學顯微鏡

10. 熒光顯微鏡

11. NIS-Elements軟件

ibidi:81176

實驗流程

01. 將GFP-A375和番茄成纖維細胞系穩定地保存在MEF培養基中，在37°C和5%C02加濕培養箱中。

02. 當細胞達到亞融合度（約80％融合度）時，在帶有PBS的通風櫥中清洗它們，以去除死細胞和碎片。

03. 在培養箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細胞約5分鐘，然后添加MEF培養基以阻止反應。

04. 將細胞懸浮液收集在15ml細胞培養管中，并用臺式離心機（1500xg,5′,RT）短暫離心。

05. 將細胞重新懸浮在新鮮培養基中；將一體積的細胞懸液與另一體積的臺盼藍溶液混合，用細胞計數器計數活細胞。

06. 在MEF緩沖液中以4x105細胞/ml的濃度稀釋細胞。

07. 在多孔板上，在每個孔的中間放置一個Culture-Insert2孔（2孔培養插件）。

08. 用75μl（3x104細胞）FP-A375細胞填充插入物一側，并用番茄成纖維細胞填充另一側。用移液器上下混合插入物中的細胞，以確保細胞完全分布。

09. 將多孔板放在培養箱中，放置過夜。

10. 第二天，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鮮的MEF培養基。

12. 用光學顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細胞之間產生的間隙的閉合狀態。

13. 一旦每個孔中的間隙完全閉合，請使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細胞尚未侵入成纖維細胞單層。

14. 小心地除去培養基，并在控制組孔中添加培養基+0.1％PBS，在處理組孔中添加培養基+300nM絲裂霉素A。將板放在培養箱中24小時（處理孵育時間）。

24小時后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養孔，以評估治療組與對照組（綠色熒光細胞散布在紅色標記層上）的腫瘤細胞侵襲行為的任何變化（圖2）。

圖1：2D侵襲系統的示意圖

圖2：2D侵襲檢測的熒光圖像

將黑素瘤細胞和成纖維細胞共培養，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小時后，評估侵襲成纖維細胞層的腫瘤細胞的數目。A375細胞顯示出大規模的侵襲行為，受到MithramycinA治療的損害。比例尺：500μm。

備注：

1.此處描述了MEF培養基組成（參考文獻1）。

2.此文僅供參考。

3.此實驗方案來自ibidi的實際用戶，更多詳情可聯系本文作者。

參考文獻：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,Nú?ezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,K?sJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

從1985年至今的30多年時間里，PCR分析經歷了三代技術的發展。DY代傳統PCR技術，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR產物進行定性分析。第二代熒光定量PCR技術，通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監控PCR進程，ZH用Cq值對基因進行定量分析。第三代數字PCR技術，通過將PCR反應液進行有限稀釋，實現核酸分子的單分子擴增，ZZ采取終點法檢測陽性微滴的熒光信號，有熒光信號的微滴判讀為 1；沒有熒光信號的微滴判讀為 0，因此該技術被稱為數字PCR。

PCR技術在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經滲透到分子生物學領域的各種研究層面。尤其在今年大流行疾病中，展現了PCR技術的強大之處。那在科學研究中，我們該如何選擇傳統PCR 、熒光定量 PCR與數字 PCR呢？

首先我們要清楚，三代PCR技術所有的基礎源于PCR反應的基本原理和PCR反應的3個重要階段，分別是指數期、線性期和平臺期。

指數期

指數期內，每個循環PCR產物量大約增加1倍（假定 100%反應效率），該階段的擴增反應具有高度特異性和精確度。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應體系成分的消耗，其中的一個或者多種成分限制反應，導致反應開始減緩，并且每個循環的PCR 產物不再加倍。

平臺期

反應停止，不再產生更多的產物。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每個反應將在不同的時間點進入平臺期，平臺期內可以看到這些差異。

傳統 PCR

傳統PCR通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR終產物進行分析（圖2），它的局限性就在于只能做定性分析。在圖3中，3個反應孔含有相同量的 DNA模板，但到達平臺期后產生的熒光信號卻不同，說明擴增產物的量存在不同（反應動力學變化所致）。這也表明了傳統PCR平臺期測量時結果存在變異，產出的DNA量不一定能反映最初情況，所以無法進行定量。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中，發現在指數期內，3個反應孔的擴增曲線完全重合，說明指數期內進行檢測將更加精確，可實現更加準確的定量。閾值線是擴增產物熒光強度超過背景時的一個熒光強度值，樣品達到此熒光強度值所經過的循環數稱為Cq值。通過比較未知濃度的樣品與一系列標準品的Cq值，可以精確測定未知反應中的模板 DNA數量。

數字 PCR

數字 PCR 是通過將樣本DNA隨機分布至獨立的反應單元中，每個反應單元中包含或者不包含1個或多個拷貝的目標分子，所有獨立的反應單元進行平行擴增后，對每個反應單元的陰性或者陽性熒光信號進行檢測并進行統計學分析，就可以計算出原始樣本的拷貝數，無需參考標準品或內源性對照品，也不需要標準曲線。

傳統PCR 、熒光定量 PCR與數字 PCR的選擇

深藍云生物科技為您提供美國Azure Cielo 3/6通道熒光定量PCR系統和

        法國Stilla Naica全自動3色/6色微滴芯片數字PCR系統。

Azure  Cielo?實時熒光定量PCR系統

來自于美國Azure Biosystems公司，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據實驗需求靈活配置。這款產品采用了高能LED作為光源系統，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統，升降溫速率快，可設置12列跨度30°C的溫度梯度；ZY的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和干擾。Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統可為您的科學研究提供高JZ度、高靈敏度和高可靠性的實驗結果。

Naica?微滴芯片式數字PCR系統

法國Stilla Technologies Naica數字PCR平臺是實現高靈敏DNA/RNAJD定量的技術工具，只需一步移液操作，即可自動生成單層平鋪的微滴，同一反應液進行多基因的單分子模板擴增，通過三色或六色熒光通道檢測，自動QC質控，識別多色熒光中有效的陰陽性微滴，從而達到目的DNA/RNA的高JZjuedui定量。同時提供原始數據、單微滴追溯等功能，確保數據真實可靠。

參考文獻：

1. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 1992;13(3):444-449.

2. Vogelstein B , Kinzler K W . Digital PCR[J]. Proceedings of the National Academy of ences of the United States of America, 1999, 96(16):9236-9241.

3. Heyries KA, Tropini C, Vaninsberghe M, et al. Megapixel digital PCR. Nat Methods. 2011;8(8):649-651.

4. Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013;59(11):1670-1672.

5. Whale AS, Huggett JF, Cowen S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(11):e82.

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原文地址：http://www.easylabplus.com/index-news-describe-html-1273.html

數字萬用表對于所有的電子電力工程師來說，肯定都再熟悉不過了。數字多用表（DMM）就是在電氣測量中要用到的電子儀器。它可以有很多特殊功能，但主要功能就是對電壓、電流、電阻和通斷等電氣參數進行測量。作為現代化的多用途電子測量儀器，主要用于電氣維護、設備檢修、研發測試等應用領域。

那么在選擇一款數字萬用表時，我們首先應該考慮哪些關鍵指標呢？今天Agitek就簡單給大家分享一下：

1、測試原理

數字萬用表測試的原理有兩種：平均響應和真有效值這兩種測試方法分別對應不同類型的電氣信號測試。對于直流信號或標準正弦波來講，不管是真有效值還是平均響應的儀表都能準確測量；但是對于含畸變波形的信號，或典型的非正弦波如方波、三角波、鋸齒形波，只有真有效值儀表才能準確測量。

2、帶寬

帶寬是數字萬用表在精度范圍內，所能響應的交流頻率范圍。它不是測量頻率的功能，而是反映交流頻率響應的能力，若被測信號頻率超過了萬用表的交流帶寬，萬用表將不能在頻率響應范圍內正確測量交流值。舉例：Fluke115C萬用表測試頻率的量程是50KHZ，但是帶寬是500HZ。這意味著當使用F115C測試信號的頻率參數時，Z高可達50KHZ。但是當被測信號頻率超過500HZ時，如果使用F115C測試信號的電壓/電流參數，測試結果則會有較大誤差，所以應選擇合適帶寬的表來測試相應的信號

3、量程

量程是指儀表在當前檔位所能夠測試的Z大值。要根據被測信號值的范圍來選擇合適的量程，福祿克萬用表均為手動/自動量程一體，方便用戶自由切換。在選擇數字萬用表時，要根據實際測試的需求來選擇合適量程的表。

4、顯示位數及分辨率

顯示位數：萬用表能夠顯示的字數范圍。通常，將能夠顯示從0-9中所有數字的位數成為整位數，其它統稱為半位。舉例：Fluke15B+的顯示位數是3999，只有三個位置上可以顯示全0-9，Z高位只能顯示0-3，則稱其為三位半的表。 而Fluke87-VC的顯示位數是19999，有四個位置上可以顯示全0-9，Z高位只能顯示0-1，則稱其為四位半的表。分辨率：描述可被識別的物理量的Z小變化。萬用表半位上顯示數字的高低和萬用表顯示位數的大小決定了一些特定讀數時的分辨率。顯示位數越大，則儀表測試時的分辨率會越高。舉例：Fluke15B+的顯示位數是3999，Fluke115C的顯示位數為5999，Fluke287C的顯示位數為49999。如果當前被測電壓的實際值為402.6V，則Fluke15B+則會顯示402V，可分辨1V級別信號的變化。Fluke115C則會顯示402.6V，可分辨0.1V級別信號的變化。而Fluke287C則會顯示402.60V，可分辨0.01V級別信號的變化。

5、其它特殊功能

其他功能如低通濾波器、雙阻抗輸入、溫度等附屬功能，應根據實際測試需求及被測信號的類型來合理選擇。

工欲善其事，必先利其器！因此，在選型階段應根據實際被測信號的類別及對要求來選擇合適的工具應對，一款Z合適的數字萬用表才能助您使命必達。以上內容由安泰測試整理，安泰測試為客戶提供選型、銷售、培訓、維修等一站式服務，如需樣機SY或者演示服務，歡迎咨詢安泰測試。