實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成為分子生物學研究不可或缺的一種技術手段，常見應用于基因表達分析、腫瘤疾病診斷、病原微生物檢測、食品安全分析和動植物育種等。qPCR檢測技術由于具有高靈敏度的特性，應盡量避免操作中的實驗誤差，確保獲得可靠真實的數據。那么如何確保實驗數據的可靠性和真實性，則需要通過對qPCR關鍵數據的評估來進行判斷。除此之外，如何分析qPCR異常數據，也是每一位qPCR實驗者需要經歷的必要環節。

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顯微鏡是由一個透鏡或幾個透鏡的組合構成的一種光學儀器，是人類進入原子時代的標志。顯微鏡是人類最偉大的發明物之一，那么該如何使用顯微鏡呢？長期使用顯微鏡的小伙伴們，長期觀察目鏡筒是否會感到眼睛酸澀？想要分享視野中的發現時是否會困擾如何去跟別人描述新發現的位置？想要記錄視野圖像時是否需要反復的找合適角度拍照？

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直播課

實時熒光定量PCR數據中的基本概念：

在整個擴增過程中會出現基線期，指數期，線性期和平臺期。其中在基線期和指數增長期，擴增產物都是以指數級增長，但是在基線期我們沒辦法檢測；而到了線性期和平臺期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴增效率差別很大，因此沒有辦法計算模板的含量。因此，在指數增長期的CT值就成了計算模板含量的關鍵值。

▲ 圖一：線性圖譜

▲ 圖二：對數圖譜

為什么知道CT值就能夠得到最初的目標基因含量呢？

如圖三，表示一個基因單次擴增曲線。N為擴增產物的分子數，模板的分子數乘以1+擴增效率的n次方，n代表循環次數。也就是說，如果擴增效率為100%，產物的分子數就等于模板數乘以2的n次方。但是在線性增長期和平臺期，擴增效率不可能是100%，因此PCR理論方程只在指數期成立，也就是圖三綠色框的部分。

▲ 圖三

數據處理：

以下三張圖分別表示我們在做熒光定量PCR時提到的三個名稱：擴增曲線、標準曲線、溶解曲線。

1、juedui定量：使用一系列稀釋的已知濃度的標準品與未知樣本同時進行測定，根據系列濃度標準品的CT值與起始模板量之間的線性比例關系。

注意事項：

?  標準品必須來源可靠，濃度已知。

?  標準品要和待測樣品同時在儀器中擴增。

?  只能根據標準品覆蓋的濃度范圍進行待測樣本濃度的推測。

2、相對定量：是用來確定經過不同處理的樣品之間的表達差異或目標在不同時相差的表達差異，也就是倍數差異。

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PCR技術以特異性的寡核苷酸引物放大擴增特定的DNA片段，一對引物在單次反應擴增單個基因。通常每個靶標分別進行檢測，即單重PCR反應，但當我們需要檢測多個靶標基因時，單重PCR費時費力同時無法排除不同樣品孔間的加樣差異，如內參基因的歸一化檢測，需要在同一反應管中檢測內參基因和目標基因，多重PCR實驗無疑是最簡單直接的解決方案。

多重PCR也稱復合PCR,是在常規PCR基礎上改進并發展起來的一種PCR擴增技術,即可在一個反應體系中加入兩對以上引物,同時擴增出多個核酸片段。在熒光定量PCR（qPCR）和數字PCR（digital PCR）技術中，多重PCR設計配合多熒光通道可以進行更多靶標的相對于標準品的檢測和直接的JD定量檢測，既具有單重PCR的敏感性和特異性，同時又比單重PCR更加GX、快捷和經濟。

多重PCR實驗具體如何進行？又有哪些注意事項？實時熒光定量PCR和數字PCR如何和多重PCR結合？北京深藍云生物科技有限公司云課堂將為您答疑解惑。

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掃描二維碼進入直播間

目前，越來越多的領域都會用到數字PCR（dPCR）技術，但關于實驗細節和結果評估缺少一個共識。在很多發表的文章中都缺乏足夠的dPCR實驗細節，這樣不利于評審文章，甚至難以根據文章重復實驗。

為了讓大家更好地遵循MIQE進行實驗，科學家依托于法國Stilla Technologies的Naica數字PCR平臺發布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR? for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通過6色熒光數字PCR技術檢測了乳腺癌相關靶點，并借此闡述了整個數字PCR操作流程以及如何運用MIQE。

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課程大綱與簡介

1.原子吸收分光光度計基本原理和結構

2.火焰法中常見的問題與解決方案

3.石墨爐法中常見的問題與解決方案

課程亮點

1.出現進樣問題時，如何進行問題排除和解決？

2.出現低靈敏度、線性差，重現性和回收率不良等問題時應采取哪些措施？

直播時間：3月17日  15:00-16:00

培訓費用：免費

聽課方式：日立微學院（提交表單后掃碼進群）

為了給您帶來更優質的服務，感謝您抽出1分鐘填寫表單完善需求。

表單地址：https://jinshuju.net/f/h2e7Gt

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同學們又是做qPCR實驗的一天，有沒有懷著忐忑又期待的心情去點開“analysis”的呢？點開之后，發現擴增曲線不正常，或者Cq值過大，又或者SD值太高，那這樣的實驗結果還靠譜嗎？現在讓小編來告訴你，qPCR實驗的成功與否，關鍵在于各組數據是否達到判定標準以及是否符合實驗預期，小小的qPCR實驗它可以變得很簡單，也可以變得很復雜，如何抓住qPCR數據分析的關鍵，是分析qPCR結果可信度的diyi步。

qPCR數據分析的關鍵

qPCR數據分析主要是利用Cq值進行計算，所以我們需要了解qPCR反應中幾個重要的參數，根據參數的表現來進行實驗評估：

擴增曲線：圖1反映的是熒光信號變化量的對數與qPCR反應循環數的關系。圖2反映的是隨著qPCR反應的進行相應的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數期很短。標準的擴增曲線是呈現出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號，然后是三個增長階段（指數增長期、線性增長期和平臺期）。

圖1：擴增曲線對數圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

圖2：擴增曲線線性圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

基線：通常3-15個循環時，熒光信號變化不大，變化趨勢接近于一條直線，即擴增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。

閾值：是一個熒光強度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線，自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置是置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Cq值：qPCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數，與起始濃度的對數成線性關系。分析定量時一般取Cq:15-35，太大或者太小都會導致定量的不準確。

圖3：擴增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

評估qPCR反應的效果

1、擴增效率及相關系數

為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，并至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。擴增效率E在90-110%之間時，認為擴增接近理想情況。

R2值：評估PCR效率的另一個關鍵參數，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1，則可以用Y值（Cq）來準確預測X值（初始模板量）。反之，如果R2等于0，就不能通過Y值來預測X值。一般認為，標準曲線的R2值大于0.98時，兩個數值之間相關的可信度很好。

圖4：標準曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

2、重復性

重復性即是指精確度，反映多次測量值之間的接近程度。標準偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值，那么標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。例如，假設PCR反應效率是100%，那么2倍稀釋點之間的平均Cq間隔應該恰為1個Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于0.250。總的來說，重復孔之間的標準偏差不大于0.2，說明實驗的重復性較好。

圖5：8個重復孔的擴增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

3、重現性

指不同批次之間或不同實驗室之間qPCR結果的變化，通常表示為拷貝數或Cq值的SD或CV。

圖6：4臺獨立的Azure Cielo 儀器上檢測GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、靈敏度

分析靈敏度是指一個樣本中可通過實驗精確測量的最小拷貝數，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測確定為陽性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測得到的濃度，可通過梯度稀釋樣品來確定ZD檢測限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導致的。假設符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測到1個拷貝。

圖7：5個數量級的動態范圍檢測。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

5、準確度

反映測量值和真實值的接近程度，以倍數變化或拷貝數進行估算。

6、特異性

指qPCR實驗中只可以檢測到目的基因，引物特異性擴增靶序列，而不會擴增其他基因序列。可通過凝膠電泳檢測擴增產物是否為單一條帶，或通過qPCR反應，根據溶解曲線是否具有單峰來判斷。

圖8：溶解曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統

來自美國Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據實驗需求靈活配置。該系統融合了高品質Peltier溫度模塊和基于光纖傳輸的光學檢測系統，可為您的科學研究就提供高jingzhun、高靈敏可靠結果。

Azure  Cielo?性能展示

?   高重現性和穩定性

連續1000次實驗后，結果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

?  高重復性

重復孔的擴增曲線高度重合

96孔重復結果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

變異系數（Cv）=0.002。

?   高分辨率

準確區分2倍濃度差異樣品

人內參cDNA（GAPDH）進行10個梯度，

2倍稀釋，3個重復，線性擬合度

R2=0.998，擴增效率E=99.89%

對于做分子生物學實驗的科研人員來說，引物探針是一個無比熟悉的詞語。不管是普通的PCR、實時熒光定量PCR（qPCR）還是靈敏度及jing準度更高的數字PCR（dPCR），高質量的引物和探針都是實驗成功的關鍵。

然而想要獲得的引物探針，得到一個好的實驗結果也并非那么容易。好的實驗結果千篇一律，不好的實驗結果各不相同，可能一不小心就有了非特異性產物或者擴增不出產物等等。從實驗小白到大神，不斷地學習和摸索是少不了的。針對不同的PCR在引物和探針設計上又有哪些不同呢？如何評估設計的引物和探針的質量呢？為了讓您少走彎路，深藍云直播間與您在線交流如何獲得更優的qPCR、dPCR引物及探針，為您的實驗助一份力！

來自美國Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統，融合了高品質Pilter溫度模塊和基于光纖傳輸的光學檢測系統，為您的科學研究提供高jing準、高靈敏的可靠結果。北京深藍云生物科技有限公司已經為您準備好了儀器，期待您的SY哦~

既然儀器已經備好了，那么該怎樣選擇檢測方法呢？

眾所周知，qPCR依托于熒光檢測技術，通過使用DNA結合染料、熒光PCR引物或探針等實時監測目的基因的擴增，從而對目的基因進行定量分析。為了避免在實驗時出差錯，下面就跟著小編一起來看一下常用的經典方法吧~

1、 DNA結合染料—SYBR Green I 法

?  原理：SYBR Green I 是一種DNA結合染料，其與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強，DNA與染料結合所釋放的熒光量與dsDNA的數量成正比。因此，檢測到的熒光信號可反映出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

?  特征：可逆熒光，Z大吸收波長497nm，Z大發射波長520nm。

?  適用情況：非特異性的熒光染料，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈（包括非特異性擴增產物、引物二聚體等）就會結合發光，在臨床上使用可能會有假陽性發生。但該方法容易建立實驗體系，可進行熔點分析，通用性好，價格相對較低，在科研中使用比較普遍。

2 、TaqMan 探針法

?  原理：檢測時除了需要一對特異性引物外，還需要一條與靶序列互補配對的寡核苷酸鏈—TaqMan探針，其5’末端包含熒光報告基團R，3’末端為淬滅基團Q。當探針與靶序列互補配對時，熒光基團發射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5’核酸外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅劑分離，發射熒光。熒光信號和產物的量相匹配。

?  特征：檢測到的是積累熒光，隨著循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。

?  適用情況：特異性較強，可進行多重qPCR分析，但成本較染料法要高一些，實驗構建相對復雜。常用的熒光基團推薦：FAM、VIC、HEX、CY5等。

3 、分子信標(molecular beacon)

?  原理：分子信標方法在檢測時除了需要一對引物以外，還需要一條呈發夾結構的寡核苷酸探針（25-40nt），分子信標的 5'端附有熒光報告基團，3'端附有淬滅基團，環被設計成與靶序列互補的15–30核苷酸，其兩端各有5-7個核苷酸互補形成莖結構，將報告基團與淬滅基團連接到一起。發夾結構中，由于報告基團接近淬滅基團，監測不到熒光信號，當環的部分與核酸序列互補配對，分子信標打開成鏈狀，使得熒光基團與淬滅劑分開，發射熒光。

?  特征：莖環結構，也是積累熒光。

?  適用情況：高特異性、可以用于多重反應，適合區分等位基因。但不能做熔點分析；發夾的莖結合過強過弱都不合適，過強的話，信標不能與靶標正確雜交，過弱的話，會隨機折疊成非發夾結構，導致產生雜信號。常用的熒光基團有FAM 、Texas Red等。

4  、熒光共振能量傳遞(FRET)

?  原理：FRET探針又稱雙雜交探針，由兩條相鄰探針組成。一個探針3'端帶有供體基團，第二個探針的5'端帶有受體基團，在PCR反應的退火步驟，兩條探針頭尾相連地分別雜交在靶標序列上，熒光分子接近，從供體到受體產生熒光共振能量傳遞，受體熒光信號的增加與擴增子出現的量成比例。

?  特征：由于FRET探針是靠近發光，所以檢測信號是實時信號，而非積累熒光。

?  適用情況：除引物外需要設計兩條探針，通用性不高；需挑選合適的供體及受體基團，供體基團發射波長與受體基團的激發波長需顯著重疊，而供體基團發射波長與受體基團的發射波長要明顯分離。可做熔點分析，特異性較強。

5 、 LUX Primers

?  原理：LUX (light upon extention) 引物是通過熒光標記的引物，使引物可以實現探針的功能。其原理和分子信標類似，LUX引物也是發夾結構，其中一條引物3’端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發夾結構，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對，發夾結構打開，產生熒光信號。

?  特征：積累熒光；不需要額外設計探針。

?  適用情況：不能進行熔點分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要專門設計探針，同時不會受非特異性擴增產物和引物二聚體的影響，特異性較SYBR Green I強。

【以上內容來源于網絡整理，侵刪】

看完了上面關于經典qPCR檢測方法的介紹，您是不是有想去跑一輪qPCR的沖動呢？

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