在之前發表的文章《實時熒光定量PCR檢測方法，你選對了嗎?》中提到，實時熒光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探針法、分子信標、熒光共振能量傳遞(FRET)和LUX Primers等。那么應用最為廣泛的則是SYBR Green染料法和TaqMan探針法，兩者各有所長。今天，先給大家介紹TaqMan探針法，它優秀在哪里？

TaqMan 探針法

最關鍵的Taqman探針，是一條與靶序列特異性結合的寡核苷酸序列，其能夠結合到正反向引物結合區域的中間部位，隨著PCR反應的進行，DNA聚合酶在延伸到探針位置時會將其水解，從而釋放熒光基團，擴增產物產生信號。

TaqMan探針法的優勢

?  高特異性，只有在探針和靶標基因之間發生特異性的水解，才會生成熒光信號。

?  多重分析，可選擇不同的報告基因染料標記探針，在一個反應管內擴增并檢測多個不同的序列。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節省材料成本。

探針序列的設計原則

1. TaqMan探針的長度zuihao不超過30bp。理想情況下，有15bp可獲得ZJ特異性；

2. Tm值在67℃-72℃之間，確保探針的Tm值比引物的高5-10℃，在退火過程中優先結合到模板上；

3. 探針序列的GC含量在20％至80％之間，避免多個重復的堿基出現，尤其要避免4個或超過4個的G堿基；

4. 探針盡量避免出現二聚體或者發夾結構，以保證足夠高的模板結合效率；

5. 探針5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時，G也可以淬滅FAM基團所發出的熒光信號，從而導致假陰性的出現。

引物探針設計不再犯愁

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如何選擇熒光基團和淬滅基團

修飾基團的選擇是探針法的重要環節，那么我們需要注意以下幾項：

1. 根據熒光定量PCR儀熒光通道，選擇適配的熒光基團，優先選擇常用的熒光基團，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根據熒光基團類型選擇淬滅基團。早期的淬滅基團TAMRA，自身會發出熒光信號，干擾檢測結果，后續慢慢地被其他淬滅基團替代。目前淬滅基團最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 進行多重qPCR檢測時，每個通道要選擇不同的熒光基團，且避免各標記基團的激發和發射波長重疊，出現熒光干擾的情況。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR

來自美國Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據實驗需求靈活配置。

除此之外，Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統融合了高品質Peltier溫度模塊和基于光纖傳輸的光學檢測系統，可為您的科學研究就提供高jingzhun、高靈敏可靠結果。

?   數據可靠性

連續1000次實驗后，結果高度一致，溫控jingzhun，性能穩定可靠。

?  應用靈活性

提供多種qPCR應用分析，定制化報告。

?   流程智能化

中英文用戶界面，觸控操作，可多機聯用。

?   交互靈活性

主機可獨立運行qPCR程序，電腦、Wi-Fi、網絡交互。

TaqMan探針法因其良好的特異性以及可多重檢測而受到實驗人員的青睞，其實除了探針法外，還有很多好的實驗方法也被實驗人員廣泛認可，這次就介紹一下另一個應用廣泛的方法：SYBR Green染料法，它又是因為哪些優點獲得實驗人員的青睞呢？

染料法原理

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，其不會與單鏈DNA結合，且在游離狀態下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光，因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯，產生實時監測的效果。

SYBR Green染料法優點

?  通用性好，適合進行大多數類型的定量反應，可以進行熔解曲線的分析。

?  無需設計探針，引物設計相對簡單，不用考慮基團選擇，易于上手；成本低，無需合成探針。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節省材料成本。

SYBR Green染料法缺點

SYBR Green染料法也有其缺點，SYBR Green染料法一個反應只能檢測一個基因，無法進行二重甚至多重的實驗。同樣的相對于TaqMan探針法其特異性較差，當引物存在二聚體或者非特異性擴增時，染料同樣可以結合并發出熒光，影響定量結果。因此對于SYBR Green染料法而言，設計一套好用的引物是重中之重。

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設計好引物后，我們該怎么進行實驗呢？

1.實驗條件的優化

我們需要對設計的引物擴增效果進行分析，使用陽性模板進行擴增，確定擴增產物為單一條帶，且大小符合設計預期，如有條件可以對擴增產物進行測序，保證準確性。當引物無問題后，進行反應條件的探索，對退火溫度進行溫度梯度檢測，找到合適的退火溫度，即PCR擴增效果好，陰性模板無擴增，條帶單一，熔解曲線單峰等。

2.預實驗

設計好引物并探索好實驗條件后，對樣本進行一次預實驗，預實驗將樣本進行梯度稀釋用以制作標準曲線，分析內參基因以及目的基因的擴增效率是否接近且在100%左右，其次可確認高濃度模板中是否有yizhi劑干擾，從而確定實驗時合適的模板濃度（樣本是否需要稀釋或濃縮）。

3.正式實驗

當我們完成了實驗條件和預實驗后就可以進行正式實驗了，每個樣品都需要3個或以上的重復，保證結果的準確性。

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?   數據可靠性

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同學們又是做qPCR實驗的一天，有沒有懷著忐忑又期待的心情去點開“analysis”的呢？點開之后，發現擴增曲線不正常，或者Cq值過大，又或者SD值太高，那這樣的實驗結果還靠譜嗎？現在讓小編來告訴你，qPCR實驗的成功與否，關鍵在于各組數據是否達到判定標準以及是否符合實驗預期，小小的qPCR實驗它可以變得很簡單，也可以變得很復雜，如何抓住qPCR數據分析的關鍵，是分析qPCR結果可信度的diyi步。

qPCR數據分析的關鍵

qPCR數據分析主要是利用Cq值進行計算，所以我們需要了解qPCR反應中幾個重要的參數，根據參數的表現來進行實驗評估：

擴增曲線：圖1反映的是熒光信號變化量的對數與qPCR反應循環數的關系。圖2反映的是隨著qPCR反應的進行相應的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數期很短。標準的擴增曲線是呈現出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號，然后是三個增長階段（指數增長期、線性增長期和平臺期）。

圖1：擴增曲線對數圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

圖2：擴增曲線線性圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

基線：通常3-15個循環時，熒光信號變化不大，變化趨勢接近于一條直線，即擴增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。

閾值：是一個熒光強度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線，自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置是置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Cq值：qPCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數，與起始濃度的對數成線性關系。分析定量時一般取Cq:15-35，太大或者太小都會導致定量的不準確。

圖3：擴增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

評估qPCR反應的效果

1、擴增效率及相關系數

為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，并至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。擴增效率E在90-110%之間時，認為擴增接近理想情況。

R2值：評估PCR效率的另一個關鍵參數，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1，則可以用Y值（Cq）來準確預測X值（初始模板量）。反之，如果R2等于0，就不能通過Y值來預測X值。一般認為，標準曲線的R2值大于0.98時，兩個數值之間相關的可信度很好。

圖4：標準曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

2、重復性

重復性即是指精確度，反映多次測量值之間的接近程度。標準偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值，那么標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。例如，假設PCR反應效率是100%，那么2倍稀釋點之間的平均Cq間隔應該恰為1個Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于0.250。總的來說，重復孔之間的標準偏差不大于0.2，說明實驗的重復性較好。

圖5：8個重復孔的擴增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

3、重現性

指不同批次之間或不同實驗室之間qPCR結果的變化，通常表示為拷貝數或Cq值的SD或CV。

圖6：4臺獨立的Azure Cielo 儀器上檢測GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、靈敏度

分析靈敏度是指一個樣本中可通過實驗精確測量的最小拷貝數，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測確定為陽性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測得到的濃度，可通過梯度稀釋樣品來確定ZD檢測限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導致的。假設符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測到1個拷貝。

圖7：5個數量級的動態范圍檢測。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

5、準確度

反映測量值和真實值的接近程度，以倍數變化或拷貝數進行估算。

6、特異性

指qPCR實驗中只可以檢測到目的基因，引物特異性擴增靶序列，而不會擴增其他基因序列。可通過凝膠電泳檢測擴增產物是否為單一條帶，或通過qPCR反應，根據溶解曲線是否具有單峰來判斷。

圖8：溶解曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統

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Azure  Cielo?性能展示

?   高重現性和穩定性

連續1000次實驗后，結果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

?  高重復性

重復孔的擴增曲線高度重合

96孔重復結果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

變異系數（Cv）=0.002。

?   高分辨率

準確區分2倍濃度差異樣品

人內參cDNA（GAPDH）進行10個梯度，

2倍稀釋，3個重復，線性擬合度

R2=0.998，擴增效率E=99.89%

你想從Western Blot小白進階到實驗高手嗎？想了解Z先進的數字PCR定量技術嗎？想了解新冠病毒數字PCR檢測方案嗎？想知道不一樣的正倒置一體熒光顯微鏡嗎？想了解實時熒光定量PCR原理與分析方法嗎？你想知道的問題都在深藍云直播課堂。

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對于做分子生物學實驗的科研人員來說，引物探針是一個無比熟悉的詞語。不管是普通的PCR、實時熒光定量PCR（qPCR）還是靈敏度及jing準度更高的數字PCR（dPCR），高質量的引物和探針都是實驗成功的關鍵。

然而想要獲得的引物探針，得到一個好的實驗結果也并非那么容易。好的實驗結果千篇一律，不好的實驗結果各不相同，可能一不小心就有了非特異性產物或者擴增不出產物等等。從實驗小白到大神，不斷地學習和摸索是少不了的。針對不同的PCR在引物和探針設計上又有哪些不同呢？如何評估設計的引物和探針的質量呢？為了讓您少走彎路，深藍云直播間與您在線交流如何獲得更優的qPCR、dPCR引物及探針，為您的實驗助一份力！

目前，越來越多的領域都會用到數字PCR（dPCR）技術，但關于實驗細節和結果評估缺少一個共識。在很多發表的文章中都缺乏足夠的dPCR實驗細節，這樣不利于評審文章，甚至難以根據文章重復實驗。

為了讓大家更好地遵循MIQE進行實驗，科學家依托于法國Stilla Technologies的Naica數字PCR平臺發布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR? for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通過6色熒光數字PCR技術檢測了乳腺癌相關靶點，并借此闡述了整個數字PCR操作流程以及如何運用MIQE。

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PCR技術以特異性的寡核苷酸引物放大擴增特定的DNA片段，一對引物在單次反應擴增單個基因。通常每個靶標分別進行檢測，即單重PCR反應，但當我們需要檢測多個靶標基因時，單重PCR費時費力同時無法排除不同樣品孔間的加樣差異，如內參基因的歸一化檢測，需要在同一反應管中檢測內參基因和目標基因，多重PCR實驗無疑是最簡單直接的解決方案。

多重PCR也稱復合PCR,是在常規PCR基礎上改進并發展起來的一種PCR擴增技術,即可在一個反應體系中加入兩對以上引物,同時擴增出多個核酸片段。在熒光定量PCR（qPCR）和數字PCR（digital PCR）技術中，多重PCR設計配合多熒光通道可以進行更多靶標的相對于標準品的檢測和直接的JD定量檢測，既具有單重PCR的敏感性和特異性，同時又比單重PCR更加GX、快捷和經濟。

多重PCR實驗具體如何進行？又有哪些注意事項？實時熒光定量PCR和數字PCR如何和多重PCR結合？北京深藍云生物科技有限公司云課堂將為您答疑解惑。

想要了解更多關于單重PCR和多重PCR實驗設計的相關信息，快來參加5月13號的直播課堂吧！

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　本生課堂：實驗室微量移液器小知識

　　微量移液器是一種標準的實驗室設備，用于精確地量取和轉移少量液體。市場上有幾種類型的微量移液器，可根據以下類型進行分類：

　　體積：固定或可變體積的微量移液器

　　操作原理：空氣置換或容積式微量移液器。

　　操作機構：機械或電子微量移液器

　　通道數：單通道或多通道微量移液器。

　　學會正確使用微量移液器被認為是一項的實驗室技能，它是微生物實驗室、醫學實驗室、大學和研究實驗室廣泛使用的工具。

　　微量移液器部件：

　　盡管微量移液器不盡相同，但所有微量移液器的基本部件都是相同的:

　　柱塞是微量移液器的最頂端部分，用于調節體積以及將所需量的液體吸入和分配到微量移液器的。柱塞中有兩個擋塊，用于在正向和反向移液中吸取液體。

　　彈出按鈕：只需按下吸頭彈出按鈕，即可輕松從微量移液器中取出吸頭，而無需接觸它們。

　　容量窗口：調整后的容量顯示在容量窗口中(要吸入/分配的容量)。

　　微量移液器軸：是充滿空氣的管子。推動活塞排出桿中包含的一定體積的空氣，釋放活塞允許這些空氣返回桿。

　　微量移液器吸頭：是附在微量移液器上的吸頭，用于收集液體，然后將其從一個地方轉移到另一個地方。不同尺寸的吸頭用于收集不同體積的液體。

　　微量移液器的類型：

　　根據體積的微量移液器類型

　　固定體積微量移液器：固定體積微量移液器的體積不能改變，每次分配時分配相同數量的液體。

　　可變體積微量移液器：可以根據微量移液器的容量(特定的最小和體積范圍)調整要吸取或分配的液體體積。

　　根據操作機制的微量移液器類型：

　　機械移液器中的柱塞壓力和真空被電動移液器中的按鈕所取代，并且可以對電動移液器進行編程以遵循您的工作協議。

　　排氣式微量移液器：當柱塞被壓下時，它會下降到儀器內部以排出空氣。排出的空氣量等于吸入/分配的液體量。

　　容積式微量移液器：柱塞與樣品直接接觸，在這些微量移液器中，包含筒和柱塞(如注射器)。

　　微量移液器如何工作?

　　當柱塞被按下時，由于微量移液器吸頭中的液體也被推出的力，微量移液器套管內的空氣被排出。

　　當活塞向上運動時，在活塞騰出的空間內產生真空。這導致吸嘴中的空氣上升以填充空置空間，然后吸嘴中的空氣被吸入吸嘴的液體代替。

　　【本文標簽】 移液器 吸頭 移液器吸頭 微量移液器

　　本生一直視質量控制為企業的生命，追求企業競爭力的不斷提升。公司在經營中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業精神作為標準，以過硬的質量和優良的服務來維護和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創美好的未來。

基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒有結束，你需要驗證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數字PCR技術來檢測基因編輯嗎？快來參加本次深藍云直播課堂吧！

顯微鏡是由一個透鏡或幾個透鏡的組合構成的一種光學儀器，是人類進入原子時代的標志。顯微鏡是人類最偉大的發明物之一，那么該如何使用顯微鏡呢？長期使用顯微鏡的小伙伴們，長期觀察目鏡筒是否會感到眼睛酸澀？想要分享視野中的發現時是否會困擾如何去跟別人描述新發現的位置？想要記錄視野圖像時是否需要反復的找合適角度拍照？

想要知道上面問題的解決辦法嗎？那就趕緊快來參加8月25日的深藍云直播課堂吧！您想知道的答案都在本次課程里，come on！

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