對于做分子生物學實驗的科研人員來說，引物探針是一個無比熟悉的詞語。不管是普通的PCR、實時熒光定量PCR（qPCR）還是靈敏度及jing準度更高的數字PCR（dPCR），高質量的引物和探針都是實驗成功的關鍵。

然而想要獲得的引物探針，得到一個好的實驗結果也并非那么容易。好的實驗結果千篇一律，不好的實驗結果各不相同，可能一不小心就有了非特異性產物或者擴增不出產物等等。從實驗小白到大神，不斷地學習和摸索是少不了的。針對不同的PCR在引物和探針設計上又有哪些不同呢？如何評估設計的引物和探針的質量呢？為了讓您少走彎路，深藍云直播間與您在線交流如何獲得更優的qPCR、dPCR引物及探針，為您的實驗助一份力！

你想從Western Blot小白進階到實驗高手嗎？想了解Z先進的數字PCR定量技術嗎？想了解新冠病毒數字PCR檢測方案嗎？想知道不一樣的正倒置一體熒光顯微鏡嗎？想了解實時熒光定量PCR原理與分析方法嗎？你想知道的問題都在深藍云直播課堂。

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目前，越來越多的領域都會用到數字PCR（dPCR）技術，但關于實驗細節和結果評估缺少一個共識。在很多發表的文章中都缺乏足夠的dPCR實驗細節，這樣不利于評審文章，甚至難以根據文章重復實驗。

為了讓大家更好地遵循MIQE進行實驗，科學家依托于法國Stilla Technologies的Naica數字PCR平臺發布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR? for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通過6色熒光數字PCR技術檢測了乳腺癌相關靶點，并借此闡述了整個數字PCR操作流程以及如何運用MIQE。

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PCR技術以特異性的寡核苷酸引物放大擴增特定的DNA片段，一對引物在單次反應擴增單個基因。通常每個靶標分別進行檢測，即單重PCR反應，但當我們需要檢測多個靶標基因時，單重PCR費時費力同時無法排除不同樣品孔間的加樣差異，如內參基因的歸一化檢測，需要在同一反應管中檢測內參基因和目標基因，多重PCR實驗無疑是最簡單直接的解決方案。

多重PCR也稱復合PCR,是在常規PCR基礎上改進并發展起來的一種PCR擴增技術,即可在一個反應體系中加入兩對以上引物,同時擴增出多個核酸片段。在熒光定量PCR（qPCR）和數字PCR（digital PCR）技術中，多重PCR設計配合多熒光通道可以進行更多靶標的相對于標準品的檢測和直接的JD定量檢測，既具有單重PCR的敏感性和特異性，同時又比單重PCR更加GX、快捷和經濟。

多重PCR實驗具體如何進行？又有哪些注意事項？實時熒光定量PCR和數字PCR如何和多重PCR結合？北京深藍云生物科技有限公司云課堂將為您答疑解惑。

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基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒有結束，你需要驗證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數字PCR技術來檢測基因編輯嗎？快來參加本次深藍云直播課堂吧！

同學們又是做qPCR實驗的一天，有沒有懷著忐忑又期待的心情去點開“analysis”的呢？點開之后，發現擴增曲線不正常，或者Cq值過大，又或者SD值太高，那這樣的實驗結果還靠譜嗎？現在讓小編來告訴你，qPCR實驗的成功與否，關鍵在于各組數據是否達到判定標準以及是否符合實驗預期，小小的qPCR實驗它可以變得很簡單，也可以變得很復雜，如何抓住qPCR數據分析的關鍵，是分析qPCR結果可信度的diyi步。

qPCR數據分析的關鍵

qPCR數據分析主要是利用Cq值進行計算，所以我們需要了解qPCR反應中幾個重要的參數，根據參數的表現來進行實驗評估：

擴增曲線：圖1反映的是熒光信號變化量的對數與qPCR反應循環數的關系。圖2反映的是隨著qPCR反應的進行相應的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數期很短。標準的擴增曲線是呈現出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號，然后是三個增長階段（指數增長期、線性增長期和平臺期）。

圖1：擴增曲線對數圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

圖2：擴增曲線線性圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

基線：通常3-15個循環時，熒光信號變化不大，變化趨勢接近于一條直線，即擴增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。

閾值：是一個熒光強度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線，自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置是置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Cq值：qPCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數，與起始濃度的對數成線性關系。分析定量時一般取Cq:15-35，太大或者太小都會導致定量的不準確。

圖3：擴增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

評估qPCR反應的效果

1、擴增效率及相關系數

為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，并至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。擴增效率E在90-110%之間時，認為擴增接近理想情況。

R2值：評估PCR效率的另一個關鍵參數，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1，則可以用Y值（Cq）來準確預測X值（初始模板量）。反之，如果R2等于0，就不能通過Y值來預測X值。一般認為，標準曲線的R2值大于0.98時，兩個數值之間相關的可信度很好。

圖4：標準曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

2、重復性

重復性即是指精確度，反映多次測量值之間的接近程度。標準偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值，那么標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。例如，假設PCR反應效率是100%，那么2倍稀釋點之間的平均Cq間隔應該恰為1個Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于0.250?？偟膩碚f，重復孔之間的標準偏差不大于0.2，說明實驗的重復性較好。

圖5：8個重復孔的擴增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

3、重現性

指不同批次之間或不同實驗室之間qPCR結果的變化，通常表示為拷貝數或Cq值的SD或CV。

圖6：4臺獨立的Azure Cielo 儀器上檢測GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、靈敏度

分析靈敏度是指一個樣本中可通過實驗精確測量的最小拷貝數，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測確定為陽性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測得到的濃度，可通過梯度稀釋樣品來確定ZD檢測限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導致的。假設符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測到1個拷貝。

圖7：5個數量級的動態范圍檢測。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

5、準確度

反映測量值和真實值的接近程度，以倍數變化或拷貝數進行估算。

6、特異性

指qPCR實驗中只可以檢測到目的基因，引物特異性擴增靶序列，而不會擴增其他基因序列。可通過凝膠電泳檢測擴增產物是否為單一條帶，或通過qPCR反應，根據溶解曲線是否具有單峰來判斷。

圖8：溶解曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統

來自美國Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統，為您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據實驗需求靈活配置。該系統融合了高品質Peltier溫度模塊和基于光纖傳輸的光學檢測系統，可為您的科學研究就提供高jingzhun、高靈敏可靠結果。

Azure  Cielo?性能展示

?   高重現性和穩定性

連續1000次實驗后，結果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

?  高重復性

重復孔的擴增曲線高度重合

96孔重復結果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

變異系數（Cv）=0.002。

?   高分辨率

準確區分2倍濃度差異樣品

人內參cDNA（GAPDH）進行10個梯度，

2倍稀釋，3個重復，線性擬合度

R2=0.998，擴增效率E=99.89%

在之前發表的文章《實時熒光定量PCR檢測方法，你選對了嗎?》中提到，實時熒光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探針法、分子信標、熒光共振能量傳遞(FRET)和LUX Primers等。那么應用最為廣泛的則是SYBR Green染料法和TaqMan探針法，兩者各有所長。今天，先給大家介紹TaqMan探針法，它優秀在哪里？

TaqMan 探針法

最關鍵的Taqman探針，是一條與靶序列特異性結合的寡核苷酸序列，其能夠結合到正反向引物結合區域的中間部位，隨著PCR反應的進行，DNA聚合酶在延伸到探針位置時會將其水解，從而釋放熒光基團，擴增產物產生信號。

TaqMan探針法的優勢

?  高特異性，只有在探針和靶標基因之間發生特異性的水解，才會生成熒光信號。

?  多重分析，可選擇不同的報告基因染料標記探針，在一個反應管內擴增并檢測多個不同的序列。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節省材料成本。

探針序列的設計原則

1. TaqMan探針的長度zuihao不超過30bp。理想情況下，有15bp可獲得ZJ特異性；

2. Tm值在67℃-72℃之間，確保探針的Tm值比引物的高5-10℃，在退火過程中優先結合到模板上；

3. 探針序列的GC含量在20％至80％之間，避免多個重復的堿基出現，尤其要避免4個或超過4個的G堿基；

4. 探針盡量避免出現二聚體或者發夾結構，以保證足夠高的模板結合效率；

5. 探針5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時，G也可以淬滅FAM基團所發出的熒光信號，從而導致假陰性的出現。

引物探針設計不再犯愁

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如何選擇熒光基團和淬滅基團

修飾基團的選擇是探針法的重要環節，那么我們需要注意以下幾項：

1. 根據熒光定量PCR儀熒光通道，選擇適配的熒光基團，優先選擇常用的熒光基團，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根據熒光基團類型選擇淬滅基團。早期的淬滅基團TAMRA，自身會發出熒光信號，干擾檢測結果，后續慢慢地被其他淬滅基團替代。目前淬滅基團最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 進行多重qPCR檢測時，每個通道要選擇不同的熒光基團，且避免各標記基團的激發和發射波長重疊，出現熒光干擾的情況。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR

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?   數據可靠性

連續1000次實驗后，結果高度一致，溫控jingzhun，性能穩定可靠。

?  應用靈活性

提供多種qPCR應用分析，定制化報告。

?   流程智能化

中英文用戶界面，觸控操作，可多機聯用。

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主機可獨立運行qPCR程序，電腦、Wi-Fi、網絡交互。

顯微鏡是由一個透鏡或幾個透鏡的組合構成的一種光學儀器，是人類進入原子時代的標志。顯微鏡是人類最偉大的發明物之一，那么該如何使用顯微鏡呢？長期使用顯微鏡的小伙伴們，長期觀察目鏡筒是否會感到眼睛酸澀？想要分享視野中的發現時是否會困擾如何去跟別人描述新發現的位置？想要記錄視野圖像時是否需要反復的找合適角度拍照？

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直播課

TaqMan探針法因其良好的特異性以及可多重檢測而受到實驗人員的青睞，其實除了探針法外，還有很多好的實驗方法也被實驗人員廣泛認可，這次就介紹一下另一個應用廣泛的方法：SYBR Green染料法，它又是因為哪些優點獲得實驗人員的青睞呢？

染料法原理

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，其不會與單鏈DNA結合，且在游離狀態下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光，因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯，產生實時監測的效果。

SYBR Green染料法優點

?  通用性好，適合進行大多數類型的定量反應，可以進行熔解曲線的分析。

?  無需設計探針，引物設計相對簡單，不用考慮基團選擇，易于上手；成本低，無需合成探針。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節省材料成本。

SYBR Green染料法缺點

SYBR Green染料法也有其缺點，SYBR Green染料法一個反應只能檢測一個基因，無法進行二重甚至多重的實驗。同樣的相對于TaqMan探針法其特異性較差，當引物存在二聚體或者非特異性擴增時，染料同樣可以結合并發出熒光，影響定量結果。因此對于SYBR Green染料法而言，設計一套好用的引物是重中之重。

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設計好引物后，我們該怎么進行實驗呢？

1.實驗條件的優化

我們需要對設計的引物擴增效果進行分析，使用陽性模板進行擴增，確定擴增產物為單一條帶，且大小符合設計預期，如有條件可以對擴增產物進行測序，保證準確性。當引物無問題后，進行反應條件的探索，對退火溫度進行溫度梯度檢測，找到合適的退火溫度，即PCR擴增效果好，陰性模板無擴增，條帶單一，熔解曲線單峰等。

2.預實驗

設計好引物并探索好實驗條件后，對樣本進行一次預實驗，預實驗將樣本進行梯度稀釋用以制作標準曲線，分析內參基因以及目的基因的擴增效率是否接近且在100%左右，其次可確認高濃度模板中是否有yizhi劑干擾，從而確定實驗時合適的模板濃度（樣本是否需要稀釋或濃縮）。

3.正式實驗

當我們完成了實驗條件和預實驗后就可以進行正式實驗了，每個樣品都需要3個或以上的重復，保證結果的準確性。

Azure Cielo?實時熒光定量PCR

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主機可獨立運行qPCR程序，電腦、Wi-Fi、網絡交互。

做蛋白研究的小伙伴都知道，一個完整的Western Blot包括了很多個步驟，從蛋白提取到配膠、上樣電泳，再到轉膜、封閉，Z后孵育一抗二抗后才能進行檢測。時間跨度非常長，而且這中間的每一步都包含了很多的小細節，稍有不慎就會導致結果出錯，然后又得從頭來過。所以，關于WB，幾乎每一經驗豐富的實驗老手都有著一本厚厚的血淚史。

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成為分子生物學研究不可或缺的一種技術手段，常見應用于基因表達分析、腫瘤疾病診斷、病原微生物檢測、食品安全分析和動植物育種等。qPCR檢測技術由于具有高靈敏度的特性，應盡量避免操作中的實驗誤差，確保獲得可靠真實的數據。那么如何確保實驗數據的可靠性和真實性，則需要通過對qPCR關鍵數據的評估來進行判斷。除此之外，如何分析qPCR異常數據，也是每一位qPCR實驗者需要經歷的必要環節。

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直 播 課 

您是否有過長時間觀察顯微鏡而眼睛酸澀？您是否有過為觀察玻片和培養皿而在兩臺顯微鏡之間奔波？您是否有過為觀察傳統顯微鏡繁冗操作而愁苦？

不必說明場全視野觀察，高清晰顯示，極簡化操作；也不必說熒光模塊自動轉換，多通道熒光疊加，圖像輔助編輯；單是正倒置一體式觀察，就備受科研工作者的青睞。

尊重傳統，勇于創新，來自ECHO公司的顯微鏡REVOLVE采用IPAD替代傳統目鏡，釋放您的雙眼；明場/熒光雙相機雙光源，提高觀察效果；APP軟件控制，簡化顯微操作；給您帶來不一樣的觀察體驗！

大家知道顯微觀察中，正置顯微鏡更適合于玻片觀察、油鏡觀察；倒置顯微鏡則更適合于培養皿/培養瓶觀察、孔板觀察，不僅如此，往往還需要明場與熒光觀察。因此，一臺顯微鏡滿足以上所有需要，就顯得彌足珍貴。

直播課

生物通“2020生命科學十大創新產品評選”活動自啟動以來，受到了各界廣泛的關注。經過一個月的投票和專家評鑒，2020生命科學十大創新產品現已揭曉。這些產品或助力新冠病毒的檢測，或從新的角度揭開生物學的復雜機制，有望推動基礎研究和臨床轉化。

在同類型的產品中，經過層層篩選，深藍云生物的新品：naica?微滴芯片式數字PCR系統，在同類產品中脫穎而出，獲得2020生命科學十大創新產品大獎。

naica?微滴芯片式數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司naica?微滴芯片數字PCR系統，源于Crystal微滴芯片數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的拷貝數濃度，融合傳統微滴式和芯片式優勢，被稱為下一代數字PCR技術。