實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)中的基本概念：

在整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)基線期，指數(shù)期，線性期和平臺(tái)期。其中在基線期和指數(shù)增長(zhǎng)期，擴(kuò)增產(chǎn)物都是以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，但是在基線期我們沒(méi)辦法檢測(cè)；而到了線性期和平臺(tái)期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴(kuò)增效率差別很大，因此沒(méi)有辦法計(jì)算模板的含量。因此，在指數(shù)增長(zhǎng)期的CT值就成了計(jì)算模板含量的關(guān)鍵值。

▲ 圖一：線性圖譜

▲ 圖二：對(duì)數(shù)圖譜

為什么知道CT值就能夠得到最初的目標(biāo)基因含量呢？

如圖三，表示一個(gè)基因單次擴(kuò)增曲線。N為擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)，模板的分子數(shù)乘以1+擴(kuò)增效率的n次方，n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說(shuō)，如果擴(kuò)增效率為100%，產(chǎn)物的分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是在線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，擴(kuò)增效率不可能是100%，因此PCR理論方程只在指數(shù)期成立，也就是圖三綠色框的部分。

▲ 圖三

數(shù)據(jù)處理：

以下三張圖分別表示我們?cè)谧鰺晒舛縋CR時(shí)提到的三個(gè)名稱：擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線。

1、juedui定量：使用一系列稀釋的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣本同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與起始模板量之間的線性比例關(guān)系。

注意事項(xiàng)：

?  標(biāo)準(zhǔn)品必須來(lái)源可靠，濃度已知。

?  標(biāo)準(zhǔn)品要和待測(cè)樣品同時(shí)在儀器中擴(kuò)增。

?  只能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品覆蓋的濃度范圍進(jìn)行待測(cè)樣本濃度的推測(cè)。

2、相對(duì)定量：是用來(lái)確定經(jīng)過(guò)不同處理的樣品之間的表達(dá)差異或目標(biāo)在不同時(shí)相差的表達(dá)差異，也就是倍數(shù)差異。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

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既然儀器已經(jīng)備好了，那么該怎樣選擇檢測(cè)方法呢？

眾所周知，qPCR依托于熒光檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)使用DNA結(jié)合染料、熒光PCR引物或探針等實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的基因的擴(kuò)增，從而對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。為了避免在實(shí)驗(yàn)時(shí)出差錯(cuò)，下面就跟著小編一起來(lái)看一下常用的經(jīng)典方法吧~

1、 DNA結(jié)合染料—SYBR Green I 法

?  原理：SYBR Green I 是一種DNA結(jié)合染料，其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)，DNA與染料結(jié)合所釋放的熒光量與dsDNA的數(shù)量成正比。因此，檢測(cè)到的熒光信號(hào)可反映出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。

?  特征：可逆熒光，Z大吸收波長(zhǎng)497nm，Z大發(fā)射波長(zhǎng)520nm。

?  適用情況：非特異性的熒光染料，不能識(shí)別特定的雙鏈，只要是雙鏈（包括非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體等）就會(huì)結(jié)合發(fā)光，在臨床上使用可能會(huì)有假陽(yáng)性發(fā)生。但該方法容易建立實(shí)驗(yàn)體系，可進(jìn)行熔點(diǎn)分析，通用性好，價(jià)格相對(duì)較低，在科研中使用比較普遍。

2 、TaqMan 探針?lè)?/span>

?  原理：檢測(cè)時(shí)除了需要一對(duì)特異性引物外，還需要一條與靶序列互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸鏈—TaqMan探針，其5’末端包含熒光報(bào)告基團(tuán)R，3’末端為淬滅基團(tuán)Q。當(dāng)探針與靶序列互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團(tuán)接近而淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’核酸外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。熒光信號(hào)和產(chǎn)物的量相匹配。

?  特征：檢測(cè)到的是積累熒光，隨著循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。

?  適用情況：特異性較強(qiáng)，可進(jìn)行多重qPCR分析，但成本較染料法要高一些，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建相對(duì)復(fù)雜。常用的熒光基團(tuán)推薦：FAM、VIC、HEX、CY5等。

3 、分子信標(biāo)(molecular beacon)

?  原理：分子信標(biāo)方法在檢測(cè)時(shí)除了需要一對(duì)引物以外，還需要一條呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針（25-40nt），分子信標(biāo)的 5'端附有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端附有淬滅基團(tuán)，環(huán)被設(shè)計(jì)成與靶序列互補(bǔ)的15–30核苷酸，其兩端各有5-7個(gè)核苷酸互補(bǔ)形成莖結(jié)構(gòu)，將報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)連接到一起。發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，由于報(bào)告基團(tuán)接近淬滅基團(tuán)，監(jiān)測(cè)不到熒光信號(hào)，當(dāng)環(huán)的部分與核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，分子信標(biāo)打開(kāi)成鏈狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開(kāi)，發(fā)射熒光。

?  特征：莖環(huán)結(jié)構(gòu)，也是積累熒光。

?  適用情況：高特異性、可以用于多重反應(yīng)，適合區(qū)分等位基因。但不能做熔點(diǎn)分析；發(fā)夾的莖結(jié)合過(guò)強(qiáng)過(guò)弱都不合適，過(guò)強(qiáng)的話，信標(biāo)不能與靶標(biāo)正確雜交，過(guò)弱的話，會(huì)隨機(jī)折疊成非發(fā)夾結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致產(chǎn)生雜信號(hào)。常用的熒光基團(tuán)有FAM 、Texas Red等。

4  、熒光共振能量傳遞(FRET)

?  原理：FRET探針又稱雙雜交探針，由兩條相鄰探針組成。一個(gè)探針3'端帶有供體基團(tuán)，第二個(gè)探針的5'端帶有受體基團(tuán)，在PCR反應(yīng)的退火步驟，兩條探針頭尾相連地分別雜交在靶標(biāo)序列上，熒光分子接近，從供體到受體產(chǎn)生熒光共振能量傳遞，受體熒光信號(hào)的增加與擴(kuò)增子出現(xiàn)的量成比例。

?  特征：由于FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測(cè)信號(hào)是實(shí)時(shí)信號(hào)，而非積累熒光。

?  適用情況：除引物外需要設(shè)計(jì)兩條探針，通用性不高；需挑選合適的供體及受體基團(tuán)，供體基團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)與受體基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)需顯著重疊，而供體基團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)與受體基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)要明顯分離。可做熔點(diǎn)分析，特異性較強(qiáng)。

5 、 LUX Primers

?  原理：LUX (light upon extention) 引物是通過(guò)熒光標(biāo)記的引物，使引物可以實(shí)現(xiàn)探針的功能。其原理和分子信標(biāo)類似，LUX引物也是發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中一條引物3’端用熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。在沒(méi)有單鏈模板的情況下，該引物自身配對(duì)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對(duì)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。

?  特征：積累熒光；不需要額外設(shè)計(jì)探針。

?  適用情況：不能進(jìn)行熔點(diǎn)分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要專門設(shè)計(jì)探針，同時(shí)不會(huì)受非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體的影響，特異性較SYBR Green I強(qiáng)。

【以上內(nèi)容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)整理，侵刪】

看完了上面關(guān)于經(jīng)典qPCR檢測(cè)方法的介紹，您是不是有想去跑一輪qPCR的沖動(dòng)呢？

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